הגדרת מצע ספציפי עבור מועמדי lipase ו פוספוליפאז
Summary
Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.
Abstract
מיקרואורגניזמים לייצר קשת רחבה של (phospho) lipases כי מופרשים על מנת להפוך מצעים חיצוניים זמינים עבור האורגניזם. לחלופין, אחרים (phospho) lipases עשויה להיות קשורה פיזי עם האורגניזם הפקת גרימת מחזור של שומנים מהותיים ולעתים קרובות והוליד שיפוץ של קרום התא. למרות lipases פוטנציאל (phospho) ניתן לחזות עם מספר אלגוריתמים כאשר רצף הגן / חלבון זמין, הוכחה ניסיונית של פעילויות האנזים, ספציפיות המצע, תפקודים פיזיולוגיים פוטנציאל שתואר פעמים רבות לא ניתנה. כתב יד זה מתאר את אופטימיזציה של תנאי assay עבור פוטנציאליים (phospho) lipases עם ספציפיות מצע ידוע ואיך להעסיק בתנאים אופטימיזציה אלה בחיפוש אחר המצע הטבעי של lipase בהתאמה (phospho). באמצעות מצעים chromogenic מלאכותיים, כגון נגזרות -nitrophenyl p, עשוי לסייע לזהות קטיןהפעילות האנזימטית עבור lipase חזה (phospho) בתנאים סטנדרטיים. שנפגש כזה פעילות האנזימטית קטין, הפרמטרים הברורים של assay אנזים יכולים להיות מגוונים על מנת להשיג הידרוליזה יעיל יותר של המצע המלאכותי. לאחר משקבע את התנאים שבם אנזים עובד היטב, מגוון מצעים טבעיים פוטנציאליים צריך להיות assayed השפלה שלהם, תהליך שיכול להיות מלווה בשיטות chromatographic ברורות. ההגדרה ספציפית מצע אנזימים חדשים, לעתים קרובות מספקת השערות עבור תפקיד פיסיולוגי פוטנציאל של אנזימים אלה, אשר לאחר מכן ניתן לבדוק באופן ניסויי. בעקבות הנחיות אלו, הצלחנו לזהות C פוספוליפאז (SMc00171) כי מדרדרת phosphatidylcholine כדי phosphocholine ו diacylglycerol, בצעד מכריע על עיצובו מחדש של ממברנות בתוך meliloti חיידק Sinorhizobium בתנאים מגבילים-זרחן של צמיחה. במשך שני ניבאו patatin-כמו phospholipases (SMc00930 ו SMc01003) מאותו אורגניזם, נוכל להגדיר מחדש ספציפיות המצע שלהם ולהבהיר כי SMc01003 הוא lipase diacylglycerol.
Introduction
גליצרול מבוסס שומנים כגון triacylglycerols ו (glycero) פוספוליפידים מהווים חשובים וכנראה מעמדות השומנים הידועות ביותר -1. Triacylglycerols (תגיות) הם שומנים או שמנים, אשר בדרך כלל לתפקד כמו שומני אחסון, ולכן כמקורות אנרגיה ופחמן פוטנציאליים. תגיות יכולות להיות מושפלות על ידי lipases, אשר מופרשים לעתים קרובות על ידי האורגניזם הפיק לעכל תגיות חיצוניות ולהפוך אותם לזמינים כמקורות פחמן. כמו כן, lipases נחקר בהרחבה לאורך השנים בשל היישומים ביוטכנולוגיים החשובים שלהם 2.
בשל אופייה amphiphilic שלהם וצורה כמעט cylindric שלהם, (glycero) התערוכה פוספוליפידים נכסים מייצרי קרום מהווים בדרך כלל את הרכיבים lipidic העיקריים של קרום bilayered 3. בשנת מיקרואורגניזמים פשוטים, כגון coli Escherichia החיידק, רק שלוש גרסות קבוצת הראש גדולות, phosphatidylglycerol (PG), cardiolipin (CL), ו phosphatidylethanolamine (PE) הם נתקלו, אף אחד לא צריך להיות מודעים לכך כל אחד מהם ניתן להחליף עם מספר לא מבוטל של רשתות acyl השומן שונות בבית SN -1 או עלייה נותנת מיקום -2 SN למספר רב של מינים מולקולריים שונים 4 . חיידקים אחרים שאולי יש פוספוליפידים אחרים בנוסף או במקום. לדוגמה, Sinorhizobium meliloti, חיידק אדמה, אשר מסוגל ליצור סימביוזה גולה שורש תיקון-חנקן עם אספסת קטניות (Sativa Medicago), מכיל בנוסף PE A (PC) השני zwitterionic פוספוליפידים, phosphatidylcholine 5. כמו כן, שומנים לא המכילים זרחן או גליצרול יכול להיות חלק amphiphilic וצורה של הממברנה התאית. לדוגמה, על תנאי גידול הגבלת זרחן, ב ס meliloti, (glycero) פוספוליפידים מוחלפים בעיקר על ידי שומנים קרום שאינם מכילים זרחן, כלומר, sulfolipids, שומנים ornithine, ו diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) -6. אצל חיידקים, DGTS נוצר מן diacylglycerol (DAG) בתוך מסלול דו-שלבי 7 אבל המקור עבור הדור DAG לא היה ברור. ניסויים Pulse-מרדף הציע PC עשוי להיות סימן מקדים עבור 8 DGTS ושימוש המתודולוגיה המתוארת בכתב היד הזה נוכל לזהות C פוספוליפאז (PlcP, SMc00171) כי נוצר בתנאים מגבילים-זרחן אשר יכול להמיר המחשב לתוך דאג phosphocholine 8.
במחקר נפרד, גילינו כי synthetase acyl-CoA (FadD) מוטציה -deficient של ס meliloti או של Escherichia coli שנצבר חומצות שומן חופשיות כאשר נכנס לשלב נייח הצמיחה 9. למרות חומצות שומן אלה נראות להיגזר ליפידים קרום, את המקור המדויק של חומצות שומן חופשיות או האנזים (ים) משחרר אותם לא היו ידוע. שוב, העסקת האסטרטגיה שמתווה בכתב היד הזה, שתי 10 patatin הדמוי (phospho) lipases (SMc00930 ואת SMc01003) שתרם להיווצרות של חומצות שומן חופשיות ב ס meliloti 11 נחזה. באופן מפתיע, SMc01003 בשימוש DAG כמו המצע להפוך אותו monoacylglycerol ולבסוף גליצרול וחומצות שומן חופשיות 11. לכן SMc01003 הוא lipase DAG (DglA).
למרות מספר אלגוריתמים קיימים לניבוי פוטנציאל (phospho) lipases 12,13, תפקידו המדויק שלהם תפקיד פיזיולוגי הוא בדרך כלל לא ידוע. כאן אנו מתארים פרוטוקול, לשבט overexpress חזה או פוטנציאל (phospho) lipases. כתב יד זה מסביר כיצד מבחני אנזים ניתן לפתח והותאמו במיוחד lipase (phospho) overexpressed באמצעות מצעי chromogenic מלאכותיים. אנו מספקים דוגמאות כיצד עם assay האנזים אופטימיזציה המצע (phospho) lipase אמיתי ניתן נתקל ואיך ממצאים אלו יכולים להיות להעשיר את הבנתנו בפיזיולוגיה של חיידקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך 20 השנים האחרונות, גנומים של אורגניזמים רבים היו רצף ועל אף נתוני רצף עושר של הגנום נוצר, פירוש פונקציונלי מפגר אחרי ולכן מעכב את הבנתנו הפונקציה הגנום. ג'ין פונקציות הגנומים לעתים קרובות מוקצות בהתבסס על דמיון לגנים של תפקוד או תופעה הידועות של מוטיבים נשמרים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-מקסיקו (CONACyT-מקסיקו) (82,614, 153,998, 253,549, ו 178,359 ב Investigación Científica BASICA וכן 118 Investigación en Fronteras de la Ciencia) ומן Dirección הגנרל דה Asuntos דה אישי Académico-Universidad הלאומית האוטונומית דה מקסיקו (DGAPA-UNAM; PAPIIT IN202616, IN203612).
Materials
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Methanol | JT Baker | 9070-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Acetic Acid | JT Baker | 9507-05 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Hexanes | JT Baker | 9309-02 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Diethylether | Sigma | 32203 | Enzymatic assays |
| bidistilled water | ANY | NA | Enzymatic assays |
| Tris Base | Sigma | T-1503 | Enzymatic assays |
| HCl | Baker | 9535-02 | Enzymatic assays |
| NaCl | Baker | 3624-01 | Enzymatic assays |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | Enzymatic assays |
| LB broth | ANY | NA | Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water |
| tryptone | Becton Dickinson and Company | 211705 | Bacterial growth |
| yeast extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | Bacterial growth |
| TY broth | ANY | NA | Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water |
| CaCl2 2 H2O | Baker | 1332-01 | Enzymatic assays |
| isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529-019 | Bacterial growth |
| Diethanolamine | Sigma | D-8885 | Enzymatic assays |
| MnCl2 | Sigma | 221279 | Enzymatic assays |
| Phospholipase A2 snake venom | Sigma | P0790 | Enzymatic assays |
| Phospholipase C Clostridium perfingrens | Sigma | P7633 | Enzymatic assays |
| Bis-p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 07422AH | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl stearate | Sigma | N3627 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl dodecanoate | Sigma | 61716 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl decanoate | Sigma | N0252 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl palmitate | Sigma | N2752 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl butyrate | Sigma | N9876 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl octanoate | Sigma | 21742 | Enzymatic assays |
| Acetic Acid, sodium salt [1-14C] | Perkin Elmer | NEC084 | Bacterial growth |
| dimethylsulfoxide (DMSO) | JT Baker | 9224-01 | Enzymatic assays |
| Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. | Merck | 105547 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Spectrometer UV/VIS Lambda 35 | Perkin Elmer | NA | Enzymatic assays |
| Storm 820 Phosphorimager | Molecular Dynamics | NA | Photostimulable Luminescence scanner |
| Multipurpose Scintillation Counter | Beckman Coulter | NA | Radioactivity Quantification |
| French Pressure Cell | ThermoSpectronic | NA | Breakage of cells |
| chromatography paper 3MM Chr | Whatman | 3030917 | TLC analysis |
| Sinorhizobium meliloti 1021our | reference 34 | studied strain | |
| Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells | Novagen | 69451 | protein expression strain |
| pET9a vector | Novagen | 69431 | protein expression vector |
| pET17b vector | Novagen | 69663 | protein expression vector |
| sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon | Becton Dickinson | 352057 | radiolabeling of bacterial cultures |
| polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30125.15 | Enzymatic assays |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol | Sigma | D9135 | lipid standard |
| L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl | Sigma | P6267 | lipid standard |
| DL-α-monopalmitin | Sigma | M1640 | lipid standard |
| palmitic acid | Sigma | P0500 | lipid standard |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M. . Lehninger, Principles of Biochemistry. , (2013).
- Jaeger, K. E., Eggert, T. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).
- Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. , 1-37 (2008).
- Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?. Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).
- De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).
- Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti. Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).
- Klug, R. M., Benning, C. Two enzymes of diacylglyceryl-O-4′-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).
- Zavaleta-Pastor, M., et al. Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).
- Pech-Canul, A., et al. FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids. J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).
- Banerji, S., Flieger, A. Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?. Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).
- Sahonero-Canavesi, D. X., et al. Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase. Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).
- Fischer, M., Pleiss, J. The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families. Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).
- Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3 – new capabilities and interfaces. Nucl. Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
- Miller, J. H. . Experiments in Molecular Genetics. , (1972).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).
- Molecular Dynamics. . Phosphorimager SI User´s Guide. , (1994).
- Dixon, M., Webb, E. . Enzymes: Third Edition. , (1979).
- Rudolph, A. E., et al. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member. J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).
- Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).
- Peppelenbosch, M. P. Kinome profiling. Scientifica (Cairo). , (2012).
- Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).
- Kuznetsova, E., et al. Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes. FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).
- Scopes, R. K. . Protein Purification, Principles and Practice. , (2010).
- Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).
