Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em> Ceratitis capitata</em
Summary
The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.
Abstract
A mosca mediterrânica da fruta (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) é uma espécie de pragas com altíssima relevância agrícola. Isto é devido ao seu comportamento reprodutivo: as fêmeas danificar a superfície externa de frutas e vegetais quando eles põem ovos e as larvas se alimentam chocado em sua polpa. Selvagem C. populações capitata são tradicionalmente controlada através de inseticidas e / ou abordagens eco-friendly, sendo o mais bem sucedido da Técnica do Inseto Estéril (SIT). O SIT baseia-se em massa criação, esterilização à base de radiação e liberação de campo dos homens que mantêm sua capacidade para acasalar, mas não são capazes de gerar descendência fértil. O advento ea subsequente rápido desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas, juntamente com a disponibilidade da sequência do genoma de mosca do mediterrâneo, impulsionou significativamente a nossa compreensão da biologia desta espécie. Isto favoreceu a proliferação de novas estratégias para a manipulação do genoma, que can ser utilizada para o controle da população.
Neste contexto, embrião microinjeção desempenha um duplo papel na expansão da caixa de ferramentas para o controle da mosca do mediterrâneo. A capacidade para interferir com a função dos genes que regulam processos biológicos fundamentais, de facto, se expande a nossa compreensão do mecanismo molecular subjacente a invasividade moscas mediterrânicas. Além disso, a capacidade de conseguir a transformação da linha germinal facilita a produção de múltiplas estirpes transgénicas que podem ser testados para futuras aplicações de campo em novas configurações de SIT. Com efeito, a manipulação genética podem ser usadas para conferir características desejáveis que podem, por exemplo, ser utilizados para monitorizar o desempenho masculino estéril no campo, ou que podem resultar em letalidade fase precoce da vida. Aqui nós descrevemos um método para microinject ácidos nucleicos em embriões de mosca do mediterrâneo para atingir estes dois objetivos principais.
Introduction
A mosca da fruta Mediterrânea (medfly) Ceratitis capitata é uma espécie cosmopolita que extensivamente danos frutas e culturas cultivadas. Pertence à família Tephritidae, que inclui várias espécies de pragas, tais como aqueles que pertencem aos géneros Bactrocera e Anastrepha. A mosca do mediterrâneo é a espécie mais estudados desta família, e tornou-se um modelo não só para o estudo das invasões de insetos 1, mas também para otimizar as estratégias de gestão de pragas 2.
A mosca do mediterrâneo é uma espécie multivoltina que podem atacar mais de 300 espécies de plantas selvagens e cultivadas 3,4. O dano é causado por ambos os adultos e as fases larvares: fêmeas acasaladas perfurar a superfície do fruto para oviposição, permitindo que microorganismos de afectar a sua qualidade comercial, enquanto que as larvas se alimentam sobre a polpa de fruta. Depois de três estádios larvares, larvas emergem a partir do hospedeiro e pupate no solo. Ceratitiscapitata exibe uma distribuição quase todo o mundo, incluindo a África, Médio Oriente, Austrália Ocidental, Central e América do Sul, Europa e áreas dos Estados Unidos 5.
As estratégias mais comuns para limitar infestações mosca do mediterrâneo envolvem o uso de inseticidas (por exemplo, Malathion, Spinosade) e a favor do meio ambiente técnica do inseto estéril (SIT) 6. A última abordagem envolve a libertação no meio natural de centenas de milhares de homens prestados esterilizado por exposição a irradiação ionizante. O acasalamento de tais machos esterilizados para fêmeas selvagens resulta em nenhuma descendência, causando uma redução no tamanho da população, o que levou à erradicação. Embora SIT tem se mostrado eficaz em várias campanhas em todo o mundo, suas principais desvantagens incluem os altos custos de criação e de esterilização de milhões de insetos para ser liberado. Marcação de indivíduos liberados é necessário distinguir estéril de insetos selvagens capturados no campo durantemonitoramento das atividades e atualmente é conseguido usando pós fluorescentes. Estes procedimentos são caros e têm efeitos colaterais indesejáveis 7.
A fim de otimizar e / ou a desenvolver abordagens mais eficazes para o controle desta praga, biologia medfly e genética têm sido amplamente explorada por inúmeros pesquisadores em todo o mundo. A disponibilidade da sequência do genoma medfly 8,9, irá facilitar novas investigações sobre as funções dos genes. RNA de interferência é uma ferramenta poderosa para tais estudos e isto pode ser conseguido através da microinjecção de ARNdc (ARN de cadeia dupla) ou siARN (pequeno ARN interferente). Esta técnica tem sido usada, por exemplo, para demonstrar que a cascata molecular determinação do sexo em C. capitata é apenas parcialmente conservada em relação ao de 10 de Drosophila.
O desenvolvimento de protocolos para microinject embriões mosca do mediterrâneo permitidos C. capitata para ser o primeiro nãoespécies de moscas -Drosophilid ser geneticamente modificados. Como os ovos são semelhantes aos de Drosophila, quer em termos de morfologia e resistência à dessecação 11, o protocolo para a entrega do DNA do plasmídeo em embriões pré-blastoderme primeiro desenvolvidos para D. melanogaster 12,13 foi inicialmente adaptada para uso em C. capitata. Estas primeiras experiências permitiu transformação de linha de germe de moscas mediterrânicas com base no elemento transponível Minos 11. Subsequentemente, o sistema original foi modificado utilizando 14 outras abordagens baseada em transposões. Este é o caso de piggyBac da Lepidoptera Trichoplusia ni 15. O protocolo já foi ainda mais otimizado e isto permitiu a transformação de outras espécies de tefritídeos 16-21 e também de muitos outros Diptera 22-31. Todos estes sistemas se baseiam na utilização de um / sistema de transformação plasmídeo ajudante vector binário típico: artificial, transpo defeituosofilhos contêm genes desejados são montados em ADN de plasmídeo e integrado no genoma do insecto, fornecendo a enzima transposase 32. Um número de linhas de mosca do mediterrâneo transgênicos foram gerados, com vários recursos, incluindo estirpes que transportam um gene letal dominante condicional que induz letalidade, estirpes produtoras do sexo masculino somente descendentes e, portanto, não exigindo estratégias de sexagem adicionais e estirpes com esperma fluorescente, o que pode aumentar a precisão da fase de monitoramento SIT 33-37. Embora a libertação na natureza de organismos transgênicos ocorreu em testes-piloto contra os mosquitos única 38,39, pelo menos uma empresa está avaliando uma série de linhagens transgênicas mosca do mediterrâneo para a sua utilização no campo 40.
Embrião microinjeção também pode favorecer o desenvolvimento de novas ferramentas de edição de genoma, tais como transcrição nucleases ativador-like efetoras (TALENS), agrupados regularmente intercaladas repete palindr�icas curtas (CRISPR) / CRISPR proteína associada 9 nuclease (Cas9) e endonucleases homing genes (HEGs), o que permitirá novos estudos evolutivos e de desenvolvimento, bem como a expansão da caixa de ferramentas da biotecnologia disponível. De edição de genoma abordagens já permitiu a geração de sistemas gene-drive em mosquitos 41, e sua transferência para o medfly é iminente. Aqui nós descrevemos um protocolo universal para microinjecting ácidos nucleicos em embriões mosca do mediterrâneo que podem ser úteis para todas as aplicações acima mencionadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microinjecção de ácidos nucleicos em embriões de insetos é uma técnica universal que facilita tanto a análise da função dos genes e das aplicações biotecnológicas.
A publicação recente de sequências do genoma de um número crescente de espécies de insectos leva a uma necessidade urgente de ferramentas para a caracterização funcional de genes de função ainda desconhecida. ARN de interferência tem provado ser um dos métodos mais valiosos para inferir funções moleculares…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all the members of the “Insect Genetics and Genomics” Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia “IMPROVE” (FS).
Materials
| 1 x injection Buffer | Buffer | 0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl | ||
| Construct Plasmid | DNA | |||
| Helper Plasmid | DNA | |||
| dsRNA | RNA | Phenol-Chloroform purified | ||
| Standard Larval food | Rearing Food | 1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer’s yeast, 1 kg soft wheat bran | ||
| Carrot Larval Food | Rearing food | 2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L | ||
| Adult Food | Rearing food | yeast extract and sugar (1:10) | ||
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | Z692247 | ||
| Injection needles | Eppendorf | 5242956000 | ||
| Microloaders | Eppendorf | 5242956003 | ||
| Double slided tape | ||||
| Whatman Black circle paper | ||||
| Bleach | Generic reagent | Diluite 1:2 before use | ||
| Paintbrush (000) | Generic tool | |||
| Micromanipulator | Instrument | Narishige | MN-153 | |
| Microinjector | Instrument | Eppendorf | Femtojet | |
| Adult cages | Generic tool | |||
| Halocarbon oil 700 | Reagent | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Ceratitis capitata | Animal | The strain used is ISPRA |
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