Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em> Mittelmeerfruchtfliege</em

Die Mittelmeerfruchtfliege (Ceratitis) Ceratitis capitata ist eine kosmopolitische Arten , die ausgiebig Schäden Früchte und Kulturpflanzen. Es gehört zur Familie Tephritidae, die zu den Gattungen Bactrocera und Anastrepha gehör mehrere Schädlingsarten, wie diejenigen einschließt. Die Mittelmeerfruchtfliege ist die am meisten untersuchten Arten dieser Familie, und es hat sich zu einem Modell nicht nur für die Untersuchung von Insekten Invasionen ^1, aber auch ² für die Optimierung von Pflanzenschutzstrategien geworden.

Die Mittelmeerfruchtfliege ist ein multivoltine Arten , die mehr als 300 Arten von Wild angreifen kann und Kulturpflanzen ^3,4. Der Schaden wird sowohl durch die Erwachsenen und die Larvenstadien: begattete durchdringen die Oberfläche der Frucht für die Eiablage, so dass Mikroorganismen ihre Handelsqualität zu beeinflussen, während die Larven ernähren sich von dem Fruchtfleisch. Nach drei Larvenstadien, Larven aus dem Wirt entstehen und in den Boden verpuppen. Ceratitiscapitata zeigt eine nahezu weltweite Verbreitung, einschließlich Afrika, dem Nahen Osten, Westaustralien, Mittel- und Südamerika, Europa und Gebieten der Vereinigten Staaten von Amerika ^5.

Die am häufigsten verwendeten Strategien Mittelmeerfruchtfliege parasitäre Erkrankungen zu begrenzen , die Verwendung von Insektiziden (zB Malathion, Spinosad) und die umweltfreundliche Sterile Insect Technique (SIT) ⁶ beinhalten. Der zweite Ansatz beinhaltet die Freisetzung in die Wildnis von Hunderttausenden von Männern gegenüber ionisierender Bestrahlung steril durch Belichtung gemacht. Die Paarung solcher sterilisierten Männchen zu wilden Weibchen führt zu keiner Nachkommen, eine Verringerung der Bevölkerungsgröße zu verursachen, was schließlich zu Ausrottung führen. Obwohl hat SIT weltweit in mehreren Kampagnen bewährt, sind seine größten Nachteile die hohen Kosten für die Aufzucht und Millionen von Insekten Sterilisation freigesetzt werden. Kennzeichnung von freigesetzten Individuen zu unterscheiden, steril von wilden Insekten im Bereich nicht erfasst währendÜberwachung der Aktivitäten und wird derzeit unter Verwendung von fluoreszierenden Pulver erreicht. Diese Verfahren sind teuer und haben unerwünschte Nebenwirkungen ^7.

Um zu optimieren und / oder wirksamer Ansätze für die Kontrolle dieses Schädlings, der Mittelmeerfruchtfliege Biologie und Genetik zu entwickeln, wurde von zahlreichen Forschern weltweit weit erforscht. Die Verfügbarkeit der Mittelmeerfruchtfliege Genomsequenz ^8,9, werden neue Untersuchungen an Genfunktionen erleichtern. RNA-Interferenz ist ein leistungsfähiges Werkzeug für solche Studien, und es kann durch die Mikroinjektion von dsRNA (doppelsträngige RNA) oder siRNA (small interfering RNA) erreicht werden. Diese Technik ist verwendet worden, zum Beispiel, dass die Geschlechtsbestimmung Molekular cascade in C. demonstrieren capitata nur teilweise gegenüber derjenigen von ¹⁰ Drosophila konserviert.

Die Entwicklung von Protokollen Mittelmeerfruchtfliege Embryonen microinject C erlaubt capitata die erste nicht zu sein-Drosophilid Fliegenarten genetisch modifiziert werden. Als seine Eier ähnlich denen von Drosophila, sowohl in Bezug auf Morphologie und Widerstand sind ¹¹ bis Desikkation, um das Protokoll Plasmid DNA in vorge blastoderm Embryonen liefern zunächst D. entwickelt melanogaster ^12,13 zunächst wurde für den Einsatz in C angepasst capitata. Diese ersten Experimente Mittelmeerfruchtfliege Keimbahntransformation erlaubt basierend auf dem Transposon – Element Minos ^11. Unter Verwendung anderer Transposon-basierte Ansätze Anschließend wurde das ursprüngliche System ¹⁴ modifiziert. Dies ist der Fall von piggyBac aus der Lepidoptera Trichoplusia ni ^15. Das Protokoll wurde seit weiter optimiert und dadurch die Transformation anderer Tephritiden Spezies ^16-21 und auch von vielen anderen Diptera ^22-31 erlaubt hat. Alle diese Systeme beruhen auf der Verwendung eines typischen binären Vektor / Helferplasmid Transformationssystem: artificial, defekte transpoSöhne gewünschten Gene enthalten , werden in das Plasmid DNA zusammengesetzt und in das Genom des Insekten integriert , indem das Transposase – Enzym ³² liefert. Eine Reihe von transgenen Mittelmeerfruchtfliege Linien wurden mit mehreren Funktionen, einschließlich Stämmen erzeugt, eine bedingte dominant-letale Gen trägt, die Letalität induziert, Stämme produzieren nur für Männer Nachkommen und erfordern somit keine zusätzlichen sexing Strategien und Stämme mit fluoreszierenden Spermien, was die Genauigkeit verbessern kann der SIT Überwachungsphase ^33-37. Obwohl die Freisetzung in der Wildnis von transgenen Organismen in Pilotversuchen gegen Mücken aufgetreten ist nur ^38,39 mindestens ein Unternehmen im Bereich ⁴⁰ eine Reihe von transgenen Mittelmeerfruchtfliege Stämme für ihre Verwendung zu bewerten.

Embryo Mikroinjektions kann auch die Entwicklung von neuen genom Editing-Tools, wie zum Beispiel Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens), gruppierten regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom wiederholt (CR favorisierenISPR) / CRISPR associated protein 9 Nuklease (Cas9) und Homing-Endonukleasen Gene (HEG), die neue evolutionäre und Entwicklungsstudien ermöglichen wird, sowie die zur Verfügung stehende biotechnologische Toolbox erweitert. Genom-Bearbeitung Ansätze erlaubt bereits die Erzeugung von Gen-Antriebssysteme in Stechmücken ^41, und deren Übertragung auf die Mittelmeerfruchtfliege steht unmittelbar bevor. Hier beschreiben wir ein universelles Protokoll für Mikroinjizierung Nukleinsäuren in der Mittelmeerfruchtfliege Embryonen, die nützlich für alle Anwendungen der oben genannten sein kann.