Доставка нуклеиновых кислот через Эмбрион микроинъекции в во всем мире насекомых-вредителей сельского хозяйства,<em> Ceratitis capitata</em

Средиземноморская плодовая муха (Medfly) Ceratitis capitata является космополитическим видов , которые экстенсивно повреждает плоды и пропашных культур. Она принадлежит к семейству Tephritidae, которая включает в себя несколько видов вредителей, таких как те , которые принадлежат к роду Bactrocera и Anastrepha. Medfly является наиболее изученным видов этого семейства, и он стал образцом не только для изучения нашествий насекомых – ^1, но и для оптимизации стратегии борьбы с вредителями ^2.

Medfly является multivoltine видов , которые могут атаковать более 300 видов диких и культурных растений ^3,4. Ущерб причинен как на взрослых, так и личиночных стадий: вязка самки прокалывают поверхность плодов для яйцекладки, позволяя микроорганизмов влиять на их товарное качество, в то время как личинки питаются на плодовой мякоти. После трех личиночной стадии, личинки выходят из хозяина и окукливаются в почве. Ceratitiscapitata отображает почти распространение во всем мире, в том числе Африки, Ближнего Востока, Западной Австралии, Центральной и Южной Америке, Европе и районах Соединенных Штатов ^5.

Наиболее распространенные стратегии для ограничения Medfly инвазии предусматривают использование инсектицидов (например, малатион, Спинозад) и экологически чистых стерильных насекомых (SIT) ^6. Последний подход предполагает выпуск в дикую природу сотен тысяч мужчин стерилизуют под воздействием ионизирующего излучения. Спаривание таких стерилизованных самцов диких самок приводит к отсутствию потомства, что приводит к уменьшению численности населения, в конечном итоге приводит к ликвидации. Хотя SIT доказала свою эффективность в нескольких кампаниях по всему миру, ее основные недостатки включают высокие затраты на выращивание и стерилизовать миллионы насекомых, которые будут освобождены. Маркировка освобожденных лиц необходимо отличать стерильными от диких насекомых, захваченных в поле во времямониторинг деятельности и в настоящее время достигается с использованием флуоресцентных порошков. Эти процедуры являются дорогостоящими и имеют нежелательные побочные эффекты ^7.

В целях оптимизации и / или разработки более эффективных подходов к борьбе с этим вредителем, Medfly биология и генетика были широко изучены многочисленными исследователями по всему миру. Наличие Medfly последовательности генома ^8,9, будет способствовать новые исследования по генных функций. РНК-интерференция является мощным инструментом для таких исследований, и это может быть достигнуто с помощью микроинъекции дцРНК (двухцепочечной РНК) или миРНК (малых интерферирующих РНК). Эта техника была использована, например, чтобы показать , что определение пола молекулярный каскад в C. capitata лишь частично сохраняется относительно у Drosophila ^10.

Разработка протоколов к microinject Medfly эмбрионов позволили С. capitata , чтобы быть первым-Drosophilid Видов мух, чтобы быть генетически модифицированы. Как его яйца аналогичны таковым у Drosophila, как с точки зрения морфологии и устойчивости к высыханию ^11, протокол для доставки плазмидной ДНК в предварительно бластодермой эмбрионов впервые разработаны для D. MELANOGASTER ^12,13 первоначально был адаптирован для использования в C. capitata. Эти первые опыты позволила Medfly трансформации зародышевой линии , основанной на элементе Миноса транспозируемого ^11. Впоследствии, исходная система была изменена ¹⁴ с использованием других подходов транспозона основе. Это случай PiggyBac от чешуекрылых Trichoplusia п ^15. Протокол с тех пор был дополнительно оптимизирован , и это позволило преобразование других видов tephritid ^16-21 , а также многих других двукрылых ^22-31. Все эти системы основаны на использовании типичного бинарного вектора / хелперов системы трансформации плазмидами: искусственный, дефектного TRANSPOсыновья , содержащие желаемых генов собраны в плазмидной ДНК , и интегрированы в геном насекомого путем подачи транспозаза фермента ^32. Ряд трансгенных Medfly линий были сформированы, с множеством функций, включая штаммы, несущие условный доминантный летальный ген, который вызывает летальность, штаммы, продуцирующие только для мужчин потомства и, таким образом, не требуя дополнительных стратегий Sexing, и штаммы с флуоресцентным спермы, что может повысить точность фазы мониторинга МСН ^33-37. Хотя выпуск в дикой природе трансгенных организмов произошло в пилотных испытаниях против комаров только ^38,39, по крайней мере , одна компания оценивает ряд трансгенных Medfly штаммов , используемых для их использования в полевых условиях ^40.

Эмбрион микроинъекции может также способствовать развитию новых инструментов генома редактирования, такие как активатор транскрипции, как эффекторных нуклеаз (Таленс), сгруппированных регулярно interspaced короткие палиндромных повторами (CRИСПИ) / CRISPR белок, ассоциированный с 9 нуклеазы (cas9) и самонаведения эндонуклеаз генов (HEGs), что позволит новые эволюционные и развития исследований, а также расширение доступного биотехнологического набор инструментов. Геном редактирования подходов уже позволило поколение генно-приводных систем в комаров ^41, и их передача в Medfly неизбежна. Здесь мы опишем универсальный протокол для microinjecting нуклеиновых кислот в Medfly эмбрионов, которые могут быть полезны для всех указанных выше применений.