"Phagosome chiusura Assay" per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)
Summary
We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.
Abstract
Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation.
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.
Introduction
La fagocitosi è una funzione delle cellule importante che inizia con il riconoscimento e vincolante di materiale alla superficie recettori, che poi porta alla internalizzazione e la degradazione del materiale ingerito. Mentre eucarioti unicellulari come il Dictyostelium discoideum e amebe stampo utilizzano fagocitosi per l'alimentazione di batteri, organismi superiori si sono evoluti con le cellule professionali. I macrofagi o cellule dendritiche sono la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni in vari tessuti e organi, e sono cruciali per attivare il sistema immunitario adattativo attraverso presentazione dell'antigene e produzione di citochine 1-4. In determinate circostanze fagocitosi può essere eseguita da fagociti non professionali, ad esempio, endoteliali e cellule epiteliali. Questo processo è importante per mantenere l'omeostasi durante lo sviluppo e in età adulta per fatturato tessuto normale e rimodellamento. fagociti Infine, specializzati come le cellule di Sertoli nel testicolo o della retinale cellule epiteliali del pigmento sono estremamente potenti fagociti 5.
La formazione di un phagosome cui il degrado di microrganismi o detriti cellulari verifica inizia con il raggruppamento dei recettori fagocitiche sulla superficie della cellula fagocitaria. eventi di segnalazione a valle di seguito il clustering dei recettori opsonic quali recettori Fc (CFR) o integrano recettori (CRS) sono stati ben caratterizzati. Tuttavia, ci sono anche numerosi recettori non opsonic tra cui i recettori Toll-like (TLR), lectine, i recettori del mannosio e recettori scavenger. Questi recettori riconoscono determinanti sulla superficie delle particelle come mannosio o fucosio residui, fosfatidilserina e lipopolisaccaridi 1,6-9.
Patogeno o detriti cellulari riconoscimento comporta legandosi e il clustering dei diversi tipi di recettore fagocitosi, che poi portano alla intensa e transitorie rimodellamento actina. In parallelo, esocitosi focale di comparti intracellularits contribuisce al rilascio di tensione della membrana ed è importante per efficiente fagocitosi di particelle più grandi. Gli eventi di segnalazione che portano alla polimerizzazione e la membrana deformazione sono stati sezionati in modelli sperimentali che hanno innescato un singolo recettore fagocitaria. Durante la fagocitosi FCR-mediato, non vi è intenso polimerizzazione actina che viene regolato da piccole GTPasi (Rac, Cdc42). Tra i loro effettori a valle, la proteina sindrome di Wiskott-Aldrich (WASP) porta all'attivazione della proteina actina-Related 2/3 complesso (Arp2 / 3) che nucleates filamenti di actina 1,2,4,10. La produzione locale di fosfatidilinositolo-4, 5-difosfato (PI (4,5) P2) è di fondamentale importanza per la polimerizzazione di actina iniziale che guida la formazione pseudopodio. La sua conversione al PI (3,4,5) P 3 è richiesto per l'estensione e la chiusura pseudopodo phagosome 11. Diversi percorsi contribuiscono alla scomparsa di PI (4,5) P 2. In primo luogo il distacco di fosfatidilinositolo fosfato KinaSES (PIPKIs) dal PI arresti phagosome (4,5) P 2 sintesi. In secondo luogo, può essere fosforilata e consumata per classe I PI3K chinasi (PI3K) e convertito in PI (3,4,5) P 3 12. Un ruolo per fosfatasi e fosfolipasi è stato anche implicato nel PI (4,5) P2 idrolisi e la rimozione di F-actina durante la fagocitosi in cellule di mammifero e in Dictyostelium 13,14. La fosfolipasi C (PLC) δ idrolizza PI (4,5) P2 in diacilglicerolo e inositolo-1,4,5- tris di fosfato. Il OCRL PI (4,5) P2 e PI (3,4,5) P 3 fosfatasi (sindrome oculocerebrorenal di Lowe) è stato anche coinvolto nella formazione phagosome. formazione locale precisa di F-actina e la sua depolimerizzazione è strettamente regolata nello spazio e nel tempo e abbiamo dimostrato che l'assunzione di compartimenti intracellulari è importante per fornire localmente la fosfatasi OCRL, contribuendo così alla depolimerizzazione actina locale alla base della coppa fagocitica <sup> 13,15. Per questo, abbiamo usato il set up sperimentale qui descritto.
I giocatori di meccanismo e molecolari necessari per la chiusura phagosome e scissione membrana rimangono poco definiti a causa delle difficoltà di visualizzazione e il monitoraggio del sito di chiusura phagosome. Fino a poco tempo, fagocitosi è stata osservata su cellule fisse o viventi che internalizzano particelle sulla loro faccia dorsale o sui loro lati, rendendo la visualizzazione tempestiva del sito di chiusura phagosome difficile. Inoltre, i metodi di fissaggio potrebbero causare retrazione delle membrane e dei pregiudizi i risultati sul prolungamento pseudopodi e la chiusura. Per contro, il saggio che abbiamo creato e descrivere qui ci permette di visualizzare estensione pseudopodo e la fase di chiusura della fagocitosi in cellule viventi 13, basato sulla microscopia totale interno riflessione (TIRFM) 16. Questa tecnica ottico utilizza un onda evanescente per eccitare fluorofori in un'area sottile all'interfaccia tra un trasparente cosìcoperchio (vetrino) e un liquido (mezzo di coltura cellulare). Lo spessore della profondità eccitazione è circa 100 nm dalla superficie solida, consentendo la visualizzazione di eventi molecolari vicino alla membrana plasmatica. TIRFM permette un alto rapporto segnale-background, e limita la fluorescenza out-of-focus raccolta e la citotossicità a causa di illuminazione di cellule.
Approfittando di TIRFM, abbiamo sviluppato il "saggio di chiusura phagosome", in cui lamelle sono attivati con poli-lisina e poi ricoperto con globuli rossi IgG-opsonizzati (IgG-GRP che). I macrofagi che esprimono proteine fluorescenti transitoriamente tag di interesse sono quindi autorizzati a fagocitare le IgG-GRP che. Mentre le cellule si staccano le particelle di destinazione che non sono a legame covalente alla superficie del vetro, le punte delle pseudopodi possono essere osservati e registrati in modalità TIRF. acquisizioni TIRF sono combinati con acquisizioni in modalità epifluorescenza, dopo aver spostato il micron fase 3 di cui sopra, che consenta la visualization della base della coppa fagocitaria. L'aggiunta di farmaci farmacologici come quelli inibire actina o dynamin durante il processo è anche possibile sezionare ulteriormente il processo a livello molecolare.
Il protocollo descritto in dettaglio qui è una linea cellulare di macrofagi murini RAW264.7 e particelle opsonizzati, ma praticamente, può essere adattato a qualsiasi altra cellula fagocitica e con altri obiettivi come perline. Questo metodo consentirà una migliore caratterizzazione del regolamento nel tempo e nello spazio degli attori molecolari coinvolti in estensione pseudopodo e chiusura phagosome durante i vari processi di fagocitosi.
Protocol
Representative Results
Discussion
The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 °C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nadège Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales” (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.
Materials
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100x, NA1.49.), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10×500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37°C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4°C before use |
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