"Phagosome Closure Assay" naar phagosome Formatie Visualiseer in drie dimensies behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM)
Summary
We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.
Abstract
Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation.
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.
Introduction
Fagocytose is een belangrijke celfunctie die begint bij de herkenning en binding van het materiaal aan receptoren oppervlakte, die vervolgens leidt tot de internalisatie en degradatie van het opgenomen materiaal. Terwijl eencellige eukaryoten, zoals de mal Dictyostelium discoideum en amoeben gebruiken fagocytose voor het voeden op bacteriën, hebben hogere organismen geëvolueerd met professionele cellen. Macrofagen of dendritische cellen zijn de eerste verdedigingslinie tegen pathogenen in verschillende weefsels en organen, en zijn van cruciaal belang voor het adaptieve immuunsysteem activeren via antigeen presentatie en cytokine productie 1-4. Onder bepaalde omstandigheden fagocytose kan worden uitgevoerd door niet-professionele fagocyten, bijvoorbeeld, endotheel- en epitheelcellen. Dit is van belang om homeostase te handhaven tijdens ontwikkeling en in de volwassenheid voor normaal weefsel omzet en hermodellering. Tenslotte gespecialiseerde fagocyten zoals Sertoli cellen in de testis of retinalepigment epitheelcellen zijn uiterst potente fagocyten 5.
De vorming van een phagosome waarbij afbraak van micro-organismen of celresten optreedt begint met de clustering van fagocytische receptoren op het oppervlak van de fagocytische cellen. Downstream signalering gebeurtenissen na clustering van opsonische receptoren zoals Fc-receptoren (FcR) of complement receptoren (CRS) zijn goed gekarakteriseerd. Er zijn echter ook vele niet-opsonische receptoren waaronder Toll-achtige receptoren (TLRs), lectinen, receptoren en mannose scavenger receptor. Deze receptoren herkennen determinanten deeltjesoppervlak zoals mannose en fucose residuen, fosfatidylserine en lipopolysacchariden 1,6-9.
Pathogeen of celresten erkenning omvat binding van en clustering van verschillende soorten fagocyterende receptor, die vervolgens leiden tot intens en voorbijgaande actine remodeling. Parallel, focale exocytose van intracellulaire compartments bijdraagt aan de afgifte van membraan spanning en is belangrijk voor een efficiënte fagocytose van grote deeltjes. De signalering gebeurtenissen die tot actine polymerisatie en membraan deformatie werden ontleed in experimentele modellen die één fagocyterende receptor geactiveerd. Tijdens FcR-gemedieerde fagocytose, is er intense actine polymerisatie die wordt gereguleerd door kleine GTPases (Rac, Cdc42). Onder hun effectoren, de Wiskott-Aldrich syndroom eiwit (WASP) leidt tot activatie van de Actin-gerelateerd eiwit 2/3 complex (Arp2 / 3) dat actine filamenten 1,2,4,10 nucleates. Lokale productie van fosfatidylinositol-4, 5-bifosfaat (PI (4,5) P2) is essentieel voor initiële actine polymerisatie die pseudopod vorming aandrijft. De omzetting PI (3,4,5) P3 vereist voor pseudopod uitbreiding en phagosome sluiting 11. Verscheidene signaalwegen tot het verdwijnen van PI (4,5) P2. Ten eerste detachement van fosfatidylinositol fosfaat kinases (PIPKIs) van de phagosome arrestaties PI (4,5) P2 synthese. Ten tweede kan worden gefosforyleerd en geconsumeerd door klasse I PI3K kinases (PI3K) en omgezet in PI (3,4,5) P3 12. Een rol voor fosfatasen en fosfolipasen is ook geïmpliceerd in PI (4,5) P2 hydrolyse en F-actine verwijdering gedurende fagocytose in zoogdiercellen en in Dictyostelium 13,14. De fosfolipase C (PLC) δ hydrolyseert PI (4,5) P2 in diacylglycerol en inositol-1,4,5- tris fosfaat. De PI (4,5) P2 en PI (3,4,5) P3 fosfatase OCRL (oculocerebrorenal syndroom van Lowe) is ook betrokken bij phagosome formatie. Nauwkeurige lokale vorming van F-actine en de depolymerisatie wordt strak gereguleerd in ruimte en tijd en we hebben aangetoond dat rekrutering van intracellulaire compartimenten belangrijk lokaal leveren de OCRL fosfatase, hetgeen bijdraagt aan lokale actine depolymerisatie aan de voet van de fagocytische cup <sup> 13,15. Hiervoor gebruikten we de experimentele set-up hier beschreven.
De spelers mechanisme en moleculaire vereist phagosome sluiting en membraan splitsing blijven slecht gedefinieerd vanwege de moeilijkheden bij het visualiseren en controleren van de plaats van phagosome sluiting. Tot voor kort werd fagocytose waargenomen op vaste of levende cellen die deeltjes internaliseren hun dorsale zijde of de zijden, waardoor de tijdige visualisatie van de plaats van sluiting phagosome moeilijk. Bovendien kan bevestigingssystemen terugtrekken van membranen en afwijking de resultaten op pseudopodia uitbreiding en sluiting veroorzaken. Daarentegen is de test die wij hebben opgezet en beschrijf hier kunnen we pseudopod uitbreiding en de afsluiting stap van fagocytose in levende cellen 13, op basis van totale interne reflectie microscopie (TIRFM) 16 visualiseren. Deze optische techniek gebruikt een uitdovende golf fluoroforen in een dunne gebied exciteren op het raakvlak tussen een transparant, zodatdeksel (dekglaasje) en een vloeistof (celkweekmedium). De dikte van de excitatie diepte ongeveer 100 nm van het vaste oppervlak, waardoor visualisatie van moleculaire gebeurtenissen dichtbij de plasmamembraan. TIRFM maakt een hoge signaal-tot-achtergrond verhouding en beperkt de out-of-focus fluorescentie verzameld en de cytotoxiciteit door verlichting van cellen.
Maken van TIRFM ontwikkelden we de "phagosome afsluiting assay" waarin dekglaasjes worden geactiveerd met polylysine en vervolgens met IgG-opsonized rode bloedcellen (IgG-SRBC). Macrofagen transiënt tot expressie fluorescent gelabelde eiwitten plaats mogen dan overspoelen de IgG-SRBC. Terwijl de cellen los doeldeeltjes die niet-covalent gebonden aan het glasoppervlak, kunnen de uiteinden van de pseudopods worden afgelezen en geregistreerd in de TIRF modus. TIRF aankopen worden gecombineerd met acquisities in de epifluorescentie wijze, na het verschuiven van de fase 3 urn boven, waardoor de visualization van de basis van de fagocytische cup. Toevoeging van farmacologische middelen zoals actine remmen of dynamin tijdens het proces mogelijk om het proces verder te ontleden op moleculair niveau.
De in detail hier beschreven protocol voor RAW264.7 murine macrofaag cellijn en geopsoniseerde deeltjes, maar praktisch kan worden aangepast aan andere fagocytische cellen en andere doelen, zoals parels. Deze methode zal een betere karakterisering van de verordening mogelijk te maken in tijd en ruimte van de moleculaire spelers die betrokken zijn bij pseudopod uitbreiding en phagosome sluiting tijdens diverse fagocytische processen.
Protocol
Representative Results
Discussion
The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 °C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nadège Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales” (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.
Materials
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100x, NA1.49.), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10×500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37°C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4°C before use |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. . Encyclopedia of Cell Biology. 2, 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
