「ファゴソーム閉鎖アッセイ」全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いて、三次元的にファゴソーム形成を可視化します
Summary
We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.
Abstract
Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation.
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.
Introduction
食作用は、その後、摂取された物質の内在化および分解につながる、認識で始まり、受容体表面への材料の結合の主要な細胞機能です。このような金型細胞性粘菌とアメーバのような単細胞真核生物は、細菌に供給するための食作用を使用していますが、高等生物はプロの細胞と進化してきました。マクロファージや樹状細胞は様々な組織や臓器中の病原体に対する防御の最前線であり、抗原提示およびサイトカイン産生1-4を通じて適応免疫系を活性化することが重要です。特定の状況下では食作用は、非専門の食細胞、 例えば、内皮細胞および上皮細胞によって行うことができます。このプロセスは、開発中と正常組織のターンオーバーおよびリモデリングのための成人期に恒常性を維持することが重要です。精巣または網膜におけるこのようなセルトリ細胞として最後に、専門的な食細胞色素上皮細胞は、非常に強力な食5です。
微生物や細胞破片の劣化が食細胞の表面上の貪食受容体のクラスタリングで開始を発生ファゴソームの形成。このようなFc受容体（FcRで）又は補体受容体（CRS）などのオプソニン受容体のクラスタリングを次の下流のシグナル伝達事象は十分に特徴づけられています。しかし、Toll様受容体（TLR）を含む非オプソニン受容体、レクチン、マンノース受容体およびスカベンジャー受容体多数のもあります。これらの受容体は、マンノースまたはフコース残基、ホスファチジルセリン、およびリポ多糖1,6-9などの粒子表面上の決定基を認識する。
病原体や細胞破片認識はに結合し、その後激しいと過渡アクチンの再構築につながる食細胞受容体のいくつかのタイプのクラスタリングを伴います。細胞内compartmenのパラレル、焦点エキソサイトーシスでtsが膜張力の解放に貢献し、大きな粒子の効率的な食作用のために重要です。アクチン重合および膜変形につながるシグナル伝達事象は、単一の貪食受容体をトリガーした実験モデルで解剖しました。 FcR媒介性の食作用の間に、低分子量GTPアーゼ（RAC、Cdc42の）によって調節される強いアクチン重合があります。その下流のエフェクターの中でも、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（WASP）は、アクチンフィラメント1,2,4,10を核とアクチン関連タンパク質複合体2/3（ARP2 / 3）の活性化をもたらします。ホスファチジルイノシトール4、5-ビスリ ン酸（PI（4,5）P 2）の現地生産は、仮足の形成を駆動する初期のアクチンの重合のために重要です。 PI（3,4,5）P 3への変換は、仮足の拡張とファゴソームの閉鎖11のために必要とされます。いくつかの経路は、PI（4,5）P 2の消失に寄与する。ホスファチジルイノシトールリン酸キナの最初に脱落ファゴソームの逮捕のPI（4,5）P 2合成からSES（PIPKIs）。第二に、それがリン酸化することができると私はキナーゼ（PI3K）をPI3Kクラスによって消費され、PI（3,4,5）P 3 12で変換されました。ホスファターゼ及びホスホリパーゼの役割はまた、哺乳動物細胞および細胞性粘菌 13,14における食作用の間にPI（4,5）P 2の加水分解およびF-アクチンの除去に暗示されています。ホスホリパーゼC（PLC）δは、ジアシルグリセロールおよびイノシトール1,4,5- トリスホスフェートにPI（4,5）P 2を加水分解する。 PI（4,5）P 2およびPI（3,4,5）P 3ホスファターゼOCRL（ロウの眼脳腎症候群）もファゴソーム形成に関与しています。 F-アクチンとその解重合の正確な局所的形成は、しっかりと空間と時間に規制され、我々は細胞内区画の募集がローカルOCRLホスファターゼを提供することが重要であることが示されている、したがって、貪食カップの底部に局所のアクチン脱重合に寄与します<sup> 13,15。このために、我々はここに記載された実験セットアップを使用していました。
機構とファゴソームの閉鎖および膜の切断のために必要とされる分子の選手が不十分なため、ファゴソーム閉鎖のサイトを可視化と監視の難しさの定義されたままです。最近まで、食作用は難しいファゴソーム閉鎖のサイトのタイムリーな可視化を行う、彼らの背面にまたはその両側に粒子を内部固定または生きている細胞で観察されました。また、固定方法は、膜とバイアス仮足の拡張と閉鎖に結果の後退を引き起こす可能性があります。これとは対照的に、我々が設定し、ここで説明しているアッセイは、私たちは偽足拡張子と内部全反射顕微鏡（TIRFM）16に基づいて、生細胞13内食作用の閉鎖ステップを、可視化することができます。この光学技術は、透明との間の界面に薄い領域でのフルオロフォアを励起するエバネッセント波を使用していますので、蓋（カバーガラス）と液体（細胞培養培地）。励起深さの厚さは、原形質膜に近い分子事象の可視化を可能にする、固体表面から約100 nmです。 TIRFMは、高い信号対バックグラウンド比を可能にし、細胞の照明に起因収集ピンボケ蛍光および細胞毒性を制限します。
TIRFMを利用して、我々は、カバースリップは、ポリ – リジンで活性化した後、IgGのオプソニン化赤血球抗体（IgG-SRBC）でで被覆された「ファゴソーム閉鎖アッセイ」を開発しました。関心の一過性の蛍光標識されたタンパク質を発現しているマクロファージは、その後のIgG-SRBCを巻き込むために許可されています。細胞は、非共有結合ガラス表面に結合している標的粒子を切り離しながら、偽足の先端部を観察し、TIRFモードで記録することができます。 TIRFの買収は、VISを可能にする、3ミクロン以上のステージをシフトした後に、落射蛍光モードでの買収と組み合わされます貪食カップのベースのualization。そのようなプロセスの間にアクチンまたはダイナミンを阻害するもののような薬理学的薬剤の添加は、分子レベルでのプロセスを分析することも可能です。
ここでは詳細に説明されたプロトコルは、RAW264.7マウスマクロファージ細胞株およびオプソニン化粒子についてであるが、実質的に、それは、他の食細胞およびビーズなどの他の標的と適合させることができます。この方法は、時間と様々な貪食過程で仮足の拡張とファゴソームの閉鎖に関与する分子の選手の空間に規制のより良い特徴付けを可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 °C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nadège Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales” (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.
Materials
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100x, NA1.49.), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10×500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37°C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4°C before use |
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