Summary

Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat

Published: September 20, 2016
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol laboratorium adaptieve evolutie van micro-organismen onder omstandigheden met behulp chemostaat cultuur te verkrijgen. Ook is genomische analyse van het vrijkomende stam besproken.

Abstract

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Introduction

Micro-organismen kunnen overleven en zich aan te passen aan verschillende omgevingen. Onder zware stress, kan de aanpassing gebeuren via de overname van heilzame fenotypes door willekeurige genomische mutaties en de daaropvolgende positieve selectie 1-3. Daarom kan microbiële cellen aangepast door het veranderen van metabole of regulerende netwerken voor een optimale groei, die wordt aangeduid als "adaptieve evolutie". Recente belangrijke microbiële tendensen, zoals het uitbreken van superbugs en het optreden van sterke microbiële stammen, zijn nauw verwant aan adaptieve evolutie onder stressvolle omstandigheden. Onder laboratoriumomstandigheden gedefinieerd, kunnen wij de mechanismen van moleculaire evolutie bestuderen en zelfs de richting van microbiële evolutie verschillende toepassingen te beheersen. In tegenstelling tot meercellige organismen, eencellige organismen zijn zeer geschikt voor adaptieve laboratorium evolutie (ALE) om de volgende redenen: ze snel herstellen, onderhouden ze grote populaties, en het is eenvoudig te maken en te onderhouden homogeneous omgevingen. Gecombineerd met recente ontwikkelingen in DNA sequencing technieken en high-throughput technologieën ALE maakt de directe waarneming van genomische veranderingen die leiden tot structurele veranderingen in regelgeving. Mutatie dynamiek en diversiteit van de bevolking zijn ook waarneembaar. Genetische manipulatie strategieën kunnen worden bepaald uit de analyse van ALE stammen 4,5.

Chemostaat cultuur is een methode die wordt gebruikt om steady-state cellen te verkrijgen en de productiviteit in fermentatieprocessen 6 te verhogen. Vers medium wordt toegevoegd en kweekbouillon wordt tijdens het proces (de laatste omvat medium en biomassa) geoogst. Langdurige kweek chemostaat echter verandert de steady-state productiviteit van de kweek en brengt de accumulatie van spontane mutaties en selectie in kweek (Figuur 1a). Onder verschillende selectiedruk (stressoren), zal de accumulatie van mutaties verbeterd. Een geleidelijke toename van stress op lange termijn chemostaat voorziet in een continue selectie van mutaties die werken tegen de gegeven stressoren, zoals temperatuur, pH, osmotische druk, voedingsmiddel verhongering, oxidatie, toxische eindproducten, enz Colony transfer van een vast medium en seriële overdracht van een vloeibaar medium (herhaalde batch cultuur) ook kunnen onderzoekers ontwikkelde micro-organismen (figuur 1b en 1c) ​​te verkrijgen. Hoewel chemostaat cultuur ingewikkelde methodes vereist, het zwembad van de diversiteit (het aantal herhalingen en de grootte van de populatie) is hoger dan die verkregen door kolonie overdracht en serial transfer technieken. De stabiele spanning blootstelling aan individuele cellen en verminderde variatie in de cellulaire toestand tijdens chemostaat cultuur (steady state) zijn andere voordelen van ALE in vergelijking met batch-cultuur gebaseerde technieken. Stress geïnduceerde ALE van Escherichia coli onderworpen aan hoge succinate omstandigheden die in dit artikel.

iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
Figuur 1: Methoden van adaptieve laboratorium evolutie (A) Chemostat;. (B) seriële overdracht; (C) kolonie overdracht. De bovenste cijfers illustreren het concept van de methoden voor het ALE en de onderste cijfers illustreren het aantal cellen die groeide tijdens ALE. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. apparatuur Voorbereiding Verkrijgen van een chemostat pot (150-250 ml) of een erlenmeyer (250 ml) die een inlaatpoort en een uitlaatpoort. Sluit de poorten met siliconenslang waardoor stroomsnelheden van 10-100 ml / uur. Optioneel gebruik van een ontluchter, een luchtuitlaat poort, en temperatuurgecontroleerde water inlaat en uitlaat poorten. Verkrijgen van een apparaat om de chemostaat pot die voorziet roeren en temperatuurregeling (of een roterende schudincubator). Verkrijgen t…

Representative Results

Voor high-succinaat stress-adaptatie, de wild-type E. coli W3110 stam werd gekweekt in een chemostat bij D = 0,1 h-1 gedurende 270 dagen (figuur 2). Figuur 2: High-succinaat spanning aanpassing van E. coli W3110 gebruik chemostaat cultuur. Dunne pijlen geven de tijdstippen waarop de concentratie stressor werd verhoogd en vetge…

Discussion

Micro-organismen zijn in staat aan te passen aan bijna alle omgevingen vanwege hun snelle groei en de genetische diversiteit. Adaptive laboratorium evolutie stelt micro-organismen om te evolueren onder omstandigheden ontworpen, die een manier van het selecteren van de individuele organismen harboring spontane mutaties die gunstig onder de gegeven omstandigheden biedt.

De chemostaat techniek robuuster te bereiken kunstmatig aangedreven evolutie dan transfertechniek om de volgende redenen: (a)…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).

Materials

Mini-chemostat fermentor Biotron Inc. manufactured by special order
silicon tubing Cole-Parmer Masterflex L/S 13 tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.
reservoir jar Bellco Media storage bottle  20 L
chemicals Sigma-Aldrich reagent grade
glucose Sigma-Aldrich G5767 ACS reagent
NH4Cl Sigma-Aldrich A9434 for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
NaCl Sigma-Aldrich 746398 ACS reagent, ≥99%
Na2HPO4·2H2O Sigma-Aldrich 4272 98.5-101%
KH2PO4  Sigma-Aldrich 795488 ACS reagent, ≥99%
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich 230391 ACS reagent, ≥98%
CaCl2 Sigma-Aldrich 793639 ACS reagent, ≥96%
thiamine·HCl  Sigma-Aldrich T4625 reagent grade, ≥99%
Na2·succinate·6H2O Sigma-Aldrich S2378 ReagentPlus, ≥99%

References

  1. Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
  2. Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
  3. Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
  4. Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
  5. Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15 (2014).
  6. Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
  7. Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
  8. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
  9. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  10. McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
  11. Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).

Play Video

Cite This Article
Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J. Vis. Exp. (115), e54446, doi:10.3791/54446 (2016).

View Video