Summary

ケモスタットを用いた微生物の適応研究所進化のための手順

Published: September 20, 2016
doi:

Summary

ここでは、ケモスタット培養を使用した条件下での微生物の適応実験室進化を取得するためのプロトコルを提示します。また、進化した株のゲノム解析について説明します。

Abstract

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Introduction

微生物が生存し、多様な環境に適応することができます。重度のストレスの下では、適応はランダムなゲノム変異とそれに続く正の選択1-3により有益な表現型の買収を経て発生する可能性があります。したがって、微生物細胞は、「適応進化」と呼ばれる最適な成長のために代謝または調節ネットワークを変更することにより、適合させることができます。このようなスーパーバグや堅牢な微生物株の発生の発生などの最近の重要な微生物の傾向は、非常に密接にストレスの多い条件下での適応進化に関連しています。定義された実験室条件の下で、我々は分子進化のメカニズムを研究、さらには様々なアプリケーションのための微生物の進化の方向を制御することができます。多細胞生物とは異なり、単細胞生物は、次のような理由から、適応実験室進化(ALE)に適しています:彼らは多くの人口を維持するため、すぐに再生成し、それはホーンを作成し、維持するのは簡単ですogeneous環境。 DNA配列決定技術と高スループット技術の最近の進歩と組み合わせることで、ALEは、全身規制の変更につながるゲノム変化を直接観察することができます。変異動態​​と人口の多様性も観測可能です。遺伝子工学戦略はALE株4,5の分析から決定することができます。

ケモスタット培養は定常状態の細胞を取得し、発酵工程6の生産性を増加させるために使用される方法です。新鮮な培地を加​​え、培養液は、工程(後者は、媒体とバイオマスを含む)中に回収されます。長期ケモスタット培養は、しかし、文化の定常状態の生産性を変化させ、培養物( 図1a)の間に自然突然変異と選択の蓄積をもたらします。様々な選択圧(ストレス)下で、突然変異の蓄積が促進されます。長期的にストレスの緩やかな増加ケモスタットは、コロニーの固体培地からの転送と、液体媒体からシリアル転送(繰り返しなど 、温度、pH、浸透圧、栄養飢餓、酸化、有毒な最終製品として、与えられたストレス因子に対して機能変異の連続選択を提供しますバッチ培養)は、研究者が進化した微生物( 図1Bおよび1C)を取得することを可能にします。ケモスタット培養は、複雑な方法が必要ですが、多様性のプール(複製と集団サイズの数)は、コロニー転送とシリアル転送技術によって得られるものよりも高くなっています。個々の細胞への安定的なストレス暴露とケモスタット培養物(定常状態)の間、細胞状態の変化を減少させたバッチ培養ベースの技術と比較して、ALEの他の利点です。高コハク酸条件にさらされた大腸菌のストレス誘発ALEは、この記事で紹介されています。

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図1:適応実験室進化の方法 (A)ケモスタット;。 (B)シリアル転送。 (C)コロニー転送。トップ数字はALEのための方法の概念を示し、下部の図は、ALEの間に成長した細胞の数を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Protocol

1.機器の準備入口ポートと出口ポートを含むケモスタットジャー(150〜250 ml)または三角フラスコ(250ml)に取得します。シリコンチューブ10〜100ミリリットル/ hrの流量を可能にするとポートを接続します。任意に、エアベント、吹出口、および温度制御された水の入口および出口ポートを使用します。 攪拌および温度制御を提供するケモスタットジャーに適した装置を?…

Representative Results

高コハク酸のストレス適応のため、野生型E.大腸菌 W3110株は、D = 0.1時間-1 270日間( 図2)でケモスタットで培養しました。 図2:Eの高コハク酸ストレス適応ケモスタット培養を使用して大腸菌 W3110。細い矢印は、ストレッサーの濃度が増加し?…

Discussion

微生物は、それらの急速な成長率と遺伝的多様性のほとんどすべての環境に適応することが可能です。適応研究室の進化は、与えられた条件の下で有益な自然突然変異を保有する生物個体を選択する方法を提供している、設計条件の下で進化した微生物を可能にします。

ケモスタット法は、以下の理由により転送技術より人工的に駆動される進化を達成するために、よ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).

Materials

Mini-chemostat fermentor Biotron Inc. manufactured by special order
silicon tubing Cole-Parmer Masterflex L/S 13 tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.
reservoir jar Bellco Media storage bottle  20 L
chemicals Sigma-Aldrich reagent grade
glucose Sigma-Aldrich G5767 ACS reagent
NH4Cl Sigma-Aldrich A9434 for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
NaCl Sigma-Aldrich 746398 ACS reagent, ≥99%
Na2HPO4·2H2O Sigma-Aldrich 4272 98.5-101%
KH2PO4  Sigma-Aldrich 795488 ACS reagent, ≥99%
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich 230391 ACS reagent, ≥98%
CaCl2 Sigma-Aldrich 793639 ACS reagent, ≥96%
thiamine·HCl  Sigma-Aldrich T4625 reagent grade, ≥99%
Na2·succinate·6H2O Sigma-Aldrich S2378 ReagentPlus, ≥99%

References

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Cite This Article
Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J. Vis. Exp. (115), e54446, doi:10.3791/54446 (2016).

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