Summary

Verfahren für Adaptive Labor Entwicklung von Mikroorganismen Mit einem Chemostat

Published: September 20, 2016
doi:

Summary

mit Chemostatkultur Hier präsentieren wir ein Protokoll adaptive gerichtete Evolution von Mikroorganismen unter Bedingungen zu erhalten. Auch genomische Analyse des entwickelten Stamm wird diskutiert.

Abstract

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Introduction

Mikroorganismen können auf unterschiedliche Umgebungen überleben und sich anzupassen. Unter starkem Stress, Anpassung kann 1-3 über Erwerb von positiven Phänotypen durch statistische genomische Mutationen und anschließende positive Selektion auftreten. Daher kann mikrobiellen Zellen anzupassen durch metabolische oder regulatorische Netzwerke für ein optimales Wachstum zu ändern, die "adaptive Evolution" bezeichnet wird. Vor kurzem sind wichtige mikrobielle Tendenzen, wie Ausbrüche von Superbugs und dem Auftreten von robusten mikrobielle Stämme, sind sehr eng miteinander verbunden Evolution unter Stressbedingungen zu adaptiv. Unter definierten Laborbedingungen, sind wir die Mechanismen der molekularen Evolution zu studieren können und sogar die Richtung der mikrobiellen Evolution für verschiedene Anwendungen zu steuern. Im Gegensatz zu mehrzelligen Organismen sind einzellige Organismen gut geeignet, um adaptive Labor Entwicklung (ALE) aus den folgenden Gründen: sie regenerieren schnell, sie pflegen große Populationen, und es ist leicht hom zu erstellen und zu pflegenogeneous Umgebungen. In Kombination mit den jüngsten Fortschritten in der DNA-Sequenzierungstechniken und Hochdurchsatz-Technologien, ermöglicht ALE für die direkte Beobachtung von genomischen Veränderungen, die zu einer systemischen regulatorischen Veränderungen führen. Mutations Dynamik und Vielfalt der Bevölkerung sind auch zu beobachten. Die Gentechnik – Strategien können aus der Analyse der ALE – Stämme 4,5 bestimmt werden.

Chemostatkultur ist eine Methode verwendet Steady-State – Zellen zu erhalten und die Produktivität bei Fermentationsprozessen 6 erhöhen. Frisches Medium wird zugesetzt und Kulturbrühe wird während des Verfahrens geerntet (letzteres enthält Medium und Biomasse). Langzeit Chemostat – Kultur, ändert jedoch den steady-state Produktivität der Kultur und bewirkt die Anhäufung von spontanen Mutationen und Selektion während der Kultivierung (Abbildung 1a). Unter verschiedenen Selektionsdruck (Stressoren), wird die Akkumulation von Mutationen verbessert. Eine allmähliche Zunahme der Spannung in einem langfristigen Chemostat sorgt für eine kontinuierliche Auswahl von Mutationen , die gegen den gegebenen Stressoren arbeiten, wie beispielsweise Temperatur, pH, osmotischer Druck, Nährstoffmangel, Oxidation, toxische Endprodukte usw. Colony Übertragung von einem festen Medium und serielle Übertragung aus einem flüssigen Medium (wiederholte Batch – Kultur) erlauben auch Forscher entwickelten Mikroorganismen (Abbildung 1b und 1c) zu erhalten. Obwohl Chemostatkultur komplizierte Methoden erfordert, ist der Pool der Vielfalt (Anzahl der Replikationen und Populationsgröße) höher als die durch Kolonie-Transfer und serielle Übertragungstechniken erhalten. Die stabile Stressbelastung auf einzelne Zellen und verringerte Veränderung der zellulären Zustand während Chemostatkultur (Steady State) sind weitere Vorteile von ALE im Vergleich zu Batch-Kultur-basierte Techniken. Stress-induzierten ALE von Escherichia coli zu hoher Succinat Bedingungen unterworfen wird in diesem Artikel eingeführt.

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Abbildung 1: Methoden der adaptiven Labor Evolution (A) Chemostat;. (B) eine serielle Übertragung; (C) Kolonie übertragen. Die Top – Zahlen das Konzept der Methoden für das ALE illustrieren, und die unteren Zahlen die Anzahl der Zellen darstellen , die während ALE wuchs. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

1. Vorbereitung der Ausrüstung Besorgen Sie sich ein Chemostat Glas (150-250 ml) oder einem Erlenmeyerkolben (250 ml) mit einer Einlassöffnung und eine Austrittsöffnung enthält. Verbinden Sie die Anschlüsse mit Silikonschlauch so dass für Flussraten von 10 bis 100 ml / h. Optional kann ein Entlüftungsventil, eine Luftaustrittsöffnung, und temperiertes Wasser Einlass- und Auslasskanäle verwenden. Besorgen Sie sich eine Vorrichtung, die geeignet für die chemostat Glas, die für das R?…

Representative Results

Für High-Succinat Stress Anpassung, die Wildtyp – E coli – W3110 – Stamm war in einem Chemostat bei D kultiviert = 0,1 h -1 für 270 Tage (Abbildung 2). Abbildung 2: High-Succinat Stress Anpassung von E. coli W3110 unter Verwendung Chemostat – Kultur. Dünne Pfeile zeigen die Zeiten , bei denen die Konzentrati…

Discussion

Mikroorganismen sind in der Lage aufgrund ihrer schnellen Wachstumsrate und der genetischen Vielfalt zu fast allen Umgebungen anzupassen. Adaptive Laborentwicklung ermöglicht Mikroorganismen unter Bedingungen entwickelt, zu entwickeln, die eine Möglichkeit der Auswahl der einzelnen Organismen beherbergt spontane Mutationen bereit, die unter den gegebenen Bedingungen von Vorteil sind.

Die chemostat Technik ist robuster für den folgenden Gründen künstlich angetrieben Evolution als Übertr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).

Materials

Mini-chemostat fermentor Biotron Inc. manufactured by special order
silicon tubing Cole-Parmer Masterflex L/S 13 tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.
reservoir jar Bellco Media storage bottle  20 L
chemicals Sigma-Aldrich reagent grade
glucose Sigma-Aldrich G5767 ACS reagent
NH4Cl Sigma-Aldrich A9434 for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
NaCl Sigma-Aldrich 746398 ACS reagent, ≥99%
Na2HPO4·2H2O Sigma-Aldrich 4272 98.5-101%
KH2PO4  Sigma-Aldrich 795488 ACS reagent, ≥99%
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich 230391 ACS reagent, ≥98%
CaCl2 Sigma-Aldrich 793639 ACS reagent, ≥96%
thiamine·HCl  Sigma-Aldrich T4625 reagent grade, ≥99%
Na2·succinate·6H2O Sigma-Aldrich S2378 ReagentPlus, ≥99%

References

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Cite This Article
Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J. Vis. Exp. (115), e54446, doi:10.3791/54446 (2016).

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