كشف اللونية البصرية من متعدد النوكليوتيدات تعدد الأشكال على منصة التلاعب هوائي القطرة
Summary
يعرض هذا العمل طريقة بسيطة والبصرية للكشف عن الأشكال المتعددة النوكليوتيدات على منصة قطرة التلاعب الهوائية. مع الطريقة المقترحة، التجربة بأكملها، بما في ذلك التلاعب الحبرية والكشف عن الأشكال المتعددة النوكليوتيدات، لا يمكن أن يؤديها قرب 23 درجة مئوية بدون مساعدة من الأدوات المتقدمة.
Abstract
تم تنفيذ وهناك طريقة بسيطة والبصرية للكشف عن تعدد الأشكال المتعددة النوكليوتيدات (MNP) على منصة قطرة التلاعب الهوائية على سطح مفتوح. واستند هذا النهج لاكتشاف الحمض النووي اللونية على النمو بوساطة التهجين تحقيقات جسيمات متناهية الصغر الذهب (تحقيقات AuNP). ويهيمن على حجم النمو وتكوين AuNP من قبل عدد من عينات من الحمض النووي تهجين مع تحقيقات. وبناء على الخصائص البصرية size- والتي تعتمد على شكل معينة من الجسيمات النانوية، وعدد من عدم التطابق في جزء عينة من الحمض النووي للتحقيقات قادر على ان يكون هناك تمييز. وأجريت الاختبارات عبر قطرات تحتوي على الكواشف وعينات من الحمض النووي على التوالي، وتم نقلها ومختلطة على منصة الهوائية مع شفط هوائي تسيطر الغشاء superhydrophobic أساس PDMS مرنة. قطرات يمكن تسليمها في وقت واحد وعلى وجه التحديد على سطح الطلق على منصة الهوائية المقترحة التي هي حيويا للغاية مع أي ممثل المؤسسة الجانبإلخ من عينات من الحمض النووي داخل قطرات. الجمع بين الأساليب المقترحة اثنين، يمكن أن يتم الكشف عن تعدد الأشكال المتعددة النوكليوتيدات وهلة على منصة الهوائية قطرة التلاعب. لا يلزم أداة إضافية. الإجراء من تثبيت قطرات على منصة إلى النتيجة النهائية تستغرق أقل من 5 دقائق، وأقل بكثير من الطرق الحالية. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج المشترك كشف حركة الأشخاص الطبيعيين يتطلب حجم العينة من ميكرولتر 10 فقط في كل عملية، وهو أقل بشكل ملحوظ من أن نظام الكلي.
Introduction
وحيدة النكليوتيد تعدد الأشكال (SNP)، وهو فارق قاعدة زوج واحد في تسلسل الحمض النووي، هي واحدة من التغيرات الجينية الأكثر شيوعا. وتفيد الدراسات الحالية أن تعدد الأشكال ترتبط مع خطر المرض، نجاعة الأدوية والآثار الجانبية للأفراد عن طريق التأثير في وظيفة الجين. وكشف 1،2 الدراسات الحديثة أيضا أن الطفرات سنتين أو متعددة النقاط (متعدد النوكليوتيدات تعدد الأشكال) تسبب أمراض معينة، والفرد الاختلافات في آثار المرض. 3،4 والكشف عن تعدد الأشكال النوكليوتيدات ذلك فمن الضروري في الغربلة المرض. طرق بسيطة وفعالة للكشف السريع للأليغنوكليوتيد] تسلسل معين ودرجة عالية من التطور في العقدين الماضيين. 1،5 المناهج الحالية لتحديد الطفرات الحمض النووي عادة ما ينطوي على إجراءات بما في ذلك تجميد التحقيق، مضان وضع العلامات، وهلام الكهربائي، وما إلى ذلك، 6،7 ولكن هذه الأساليب تتطلب عادة عملية تحليلية طويلة، expenمعدات SIVE والفنيين المدربين تدريبا جيدا، واستهلاك كبير من العينات والكواشف.
وجسيمات متناهية الصغر مع نسبة كبيرة من المساحة السطحية لحجم وخصائص الفيزيائية فريدة من نوعها هو مادة مثالية كمنصة كشف حساسة للغاية ورخيصة للمؤشرات حيوية محددة. وتستخدم جزيئات الذهب (AuNP) على نطاق واسع للكشف عن الحمض النووي نظرا لقدرتها الكبيرة التي يمكن تعديلها مع تحقيقات قليل النوكليوتيد. وقد وضعت 8-10 تقنيات الكشف SNP أيضا باستخدام AuNP 11-13 في هذا العمل اعتمدنا نهجا اللونية رواية للكشف عن متعددة النوكليوتيدات تعدد الأشكال (MNP) من خلال الحمض النووي النمو بوساطة التهجين تحقيقات AuNP 14 يستند هذا الأسلوب يحقق بسيط وسريع على النظرية القائلة بأن أطوال مختلفة من الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA) أو المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA) مترافق ل AuNP التأثير على حجم النمو وشكل AuNP (انظر الشكل 1). 15 هذه الطريقة في الكشف عن الحمض النووييتميز استهلاك قليل من الكواشف، مدة الفحص صغيرة (بضع دقائق)، وإجراء بسيط دون رقابة الحرارية التي تنطبق بأثر رجعي للتشخيص السريري والفحص الطبي المحلي.
وقد تم تطوير عدة أنظمة الموائع الدقيقة للكشف عن تسلسل الحمض النووي (16)؛ تلك النظم الموائع الدقيقة، تطورت من البروتوكولات التجريبية التقليدية، مطلوب قطع أقل من معدات واسعة النطاق وتبسيط البروتوكولات التجريبية وذلك لتحسين حساسية، والحد من الكشف وخصوصية الحمض النووي جهاز الاستشعار البيولوجي. طرق اكتشاف الحمض النووي في أنظمة الموائع الدقيقة لا تزال تتطلب، ومع ذلك، أدوات عملية لاحقة مثل PCR (تفاعل البلمرة المتسلسل) آلة لتضخيم إشارة وقارئ مضان لقراءات واحدة لتحديد SNP غير المتجانسة. 17،18 تطوير بسيط منصة دون معالجة لاحقة لقراءة مباشرة من نتائج تعدد الأشكال المتعددة النوكليوتيداتغير مرغوب فيه للغاية. مقارنة مع استخدامها بشكل جيد، التقليدية، أغلقت أنظمة الموائع الدقيقة، وأرض مفتوحة أجهزة ميكروفلويديك تقدم اعدة العديد من المزايا، مثل مسار واضح البصرية، وسيلة سهلة للوصول إلى عينة، والوصول البيئي المباشر والتجويف لا يسهل تشكيلها أو عرقلة بينية في عرض قناة 19 عملنا السابق منصة الهوائية بسيطة لسطح مفتوح قطرة التلاعب (انظر الشكل 2). 20 وعلى هذا المنبر، قطرات يمكن نقلها في وقت واحد والتلاعب به دون تدخل من الطاقة الدافعة باستخدام قوة شفط، والتي لديها امكانات كبيرة في التطبيقات البيولوجية والكيميائية. وهكذا تستخدم هذه المنصة الهوائية لتنفيذ التلاعب في عينات من الحمض النووي للكشف عن حركة الأشخاص الطبيعيين في تركيبة مع النهج اللونية باستخدام مفهوم الحمض النووي النمو بوساطة التهجين تحقيقات AuNP.
يصف بروتوكول المعروضة في هذه الورقةكشف بصري بسيط من الأشكال متعددة النوكليوتيدات على منصة الهوائية قطرة التلاعب على سطح مفتوح. هذا العمل يؤكد متعددة النوكليوتيدات تعدد الأشكال هو كشفها بالعين المجردة. منصة الهوائية المقترحة هي مناسبة للتطبيقات البيولوجية والكيميائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، وهي طريقة اللونية بسيط للكشف عن حركة الأشخاص الطبيعيين يمكن تنفيذها بتركيزات تتراوح بين 0،11-0،50 ميكرومتر في أنابيب microcentrifuge. وعلاوة على ذلك، يجري الطريقة المقترحة كشف حركة الأشخاص الطبيعيين على منصة التلاعب قطرات الهوائية التي لديها امكانات عالية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.
Materials
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5 -end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
References
- Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
- Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408 (2010).
- Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).
- Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
- Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
- Kwok, P. Y., Chen, X. Detection of single nucleotide polymorphisms. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).
- Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
- Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
- Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
- Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
- Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
- Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
- Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
- Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
- Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
- Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
- Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
- Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
- Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
- Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
- Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
- Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
- Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).
