Il colorimetrico rilevamento visivo del Multi-nucleotide polimorfismi su una piattaforma di manipolazione pneumatica Droplet
Summary
Questo lavoro presenta un metodo semplice e visivo per rilevare polimorfismi multi-nucleotide su una piattaforma di manipolazione gocciolina pneumatica. Con il metodo proposto, l'intero esperimento, compresi manipolazione gocciolina e la rilevazione dei polimorfismi multi-nucleotidi, può essere eseguita vicino a 23 ° C senza l'ausilio di strumenti avanzati.
Abstract
Un metodo semplice e visivo per rilevare multi-nucleotide polimorfismo (MNP) è stata eseguita su una piattaforma manipolazione gocciolina pneumatico su una superficie aperta. Questo approccio alla rilevazione DNA colorimetrica è stata basata sulla crescita ibridazione mediata sonde nanoparticelle di oro (sonde AUNP). La dimensione di crescita e la configurazione del AUNP sono dominate dal numero di campioni di DNA ibridato con sonde. Sulla base delle specifiche proprietà ottiche Grandezza- e dipendente dalla forma delle nanoparticelle, il numero dei disallineamenti in un frammento di DNA campione sonde è in grado di essere discriminati. Le prove sono state condotte tramite goccioline contenenti i reagenti ei campioni di DNA, rispettivamente, e sono stati trasportati e mescolati sulla piattaforma pneumatico con l'aspirazione pneumatica controllata della membrana superhydrophobic flessibili PDMS-based. Goccioline possono essere erogati contemporaneamente e precisamente su una superficie aperta sulla piattaforma pneumatica proposto che è altamente biocompatibile senza eff latoect di campioni di DNA all'interno delle goccioline. Combinando i due metodi proposti, polimorfismo multi-nucleotide può essere rilevato a vista sulla piattaforma manipolazione gocciolina pneumatica; è richiesto alcuno strumento aggiuntivo. La procedura di installare le goccioline sulla piattaforma al risultato finale richiede meno di 5 minuti, molto meno rispetto ai metodi esistenti. Inoltre, questo approccio combinato rilevamento MNP richiede un volume del campione di soli 10 microlitri in ogni operazione, che è notevolmente inferiore a quello di un sistema macro.
Introduction
Polimorfismo a singolo nucleotide (SNP), che è un singolo differenza base-pair in una sequenza di DNA, è una delle varianti genetiche più comuni. Gli studi attuali riportano che SNP sono associati con il rischio di malattia, efficacia dei farmaci e gli effetti collaterali di individui che alterano la funzione del gene. 1,2 Recenti studi hanno anche rivelato che le mutazioni a due o multi-punto (multi-nucleotide polimorfismo) causano malattie particolari e individuali differenze negli effetti della malattia. 3,4 Il rilevamento di nucleotide polimorfismo è quindi indispensabile in preselezione malattia. Metodi semplici ed efficienti per la rapida individuazione di oligonucleotidi sequenza-specifici sono stati molto sviluppati negli ultimi due decenni. 1,5 approcci in corso per individuare mutazioni del DNA tipicamente coinvolgono procedure, tra cui la sonda immobilizzazione, l'etichettatura di fluorescenza, elettroforesi su gel, ecc, 6,7 ma questi metodi richiedono generalmente un lungo processo analitico, expenattrezzature sive, i tecnici ben addestrati, e il consumo significativo di campioni e reagenti.
Una nanoparticella con un elevato rapporto tra superficie e volume e uniche proprietà fisico è un materiale ideale come piattaforma di rilevazione altamente sensibile e conveniente per la biomarker specifici. Nanoparticelle d'oro (AUNP) sono ampiamente utilizzati per la rilevazione del DNA a causa della loro grande capacità di essere modificato con sonde oligonucleotidiche. 8-10 tecniche di rilevamento SNP sono stati sviluppati utilizzando AUNP. 11-13 In questo lavoro abbiamo adottato un approccio colorimetrico romanzo per rilevare la multi-nucleotide polimorfismo (MNP) attraverso il DNA crescita ibridazione mediata delle sonde AUNP. 14 Questo metodo di sondaggio semplice e rapida si basa sulla teoria che varie lunghezze di DNA a singolo filamento (ssDNA) o DNA a doppia elica (dsDNA) coniugata AUNP influenzare la dimensione di crescita e la forma del AUNP (vedi Figura 1). 15 Questo metodo di rilevazione del DNApresenta un piccolo consumo di reagenti, una piccola durata dosaggio (pochi minuti), e una semplice procedura senza controllo termico che prospetticamente applicabile per la diagnosi clinica e screening medico domestico.
Diversi sistemi microfluidici per rilevare la sequenza di DNA sono stati sviluppati; 16 tali sistemi microfluidici, evoluto da protocolli sperimentali tradizionali, richiesto meno pezzi di grandi attrezzature e semplificato protocolli sperimentali in modo da migliorare la sensibilità, limite di rilevamento e la specificità del DNA biosensore. Metodi di rilevamento DNA nei sistemi microfluidici ancora richiedono, tuttavia, strumenti di un processo successivo come una PCR (polymerase chain reaction) Macchina per l'amplificazione del segnale e un lettore di fluorescenza per una singola lettura per identificare il eterogenea SNP. 17,18 Sviluppare un semplice piattaforma senza il successivo trattamento di leggere direttamente i risultati di multi-nucleotide polimorfismoè altamente desiderabile. Rispetto alla ben utilizzato, convenzionale, chiuso sistemi microfluidici, aperta superficie dispositivi microfluidici offrono promettente diversi vantaggi, quali un chiaro percorso ottico, un modo semplice per accedere all'esempio, una accessibilità ambientale diretto e cavitazione non formano facilmente o ostruzione interfacciale in il canale. 19 il nostro lavoro precedente introdotto una piattaforma pneumatica semplice manipolazione open-superficie gocciolina (vedere Figura 2). 20 Su questa piattaforma, goccioline possono essere simultaneamente trasportati e manipolati senza interferenze da un'energia guida utilizzando una forza di aspirazione, che ha un grande potenziale in applicazioni chimiche e biologiche. Questa piattaforma pneumatico è stato quindi utilizzato per eseguire la manipolazione dei campioni di DNA per il rilevamento MNP in combinazione con il metodo colorimetrico utilizzando il concetto di DNA crescita ibridazione mediata delle sonde AUNP.
Il protocollo presentato in questo documento descriveun semplice riconoscimento visivo delle polimorfismi multi-nucleotide sulla piattaforma manipolazione gocciolina pneumatico su una superficie aperta. Questo lavoro conferma che il multi-nucleotide polimorfismo è rilevabile ad occhio nudo; la piattaforma pneumatica proposto è adatto per applicazioni chimiche e biologiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, un semplice metodo colorimetrico per rilevare MNP può essere implementato a concentrazioni comprese tra 0.11-0.50 micron di provette da microcentrifuga. Inoltre, il metodo di rilevamento MNP proposto è condotta su una piattaforma manipolazione gocciolina pneumatico che ha un elevato potenziale per lo screening del DNA e altre applicazioni biomediche. In pratica, l'intervallo rilevabile della concentrazione di DNA campione dipende l'efficienza di miscelazione delle piattaforme operative. P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.
Materials
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5 -end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
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