La détection Colorimétrie visuelle de Multi-nucleotide polymorphismes sur une plate-forme de manipulation pneumatique Droplet
Summary
Ce travail présente une méthode simple et visuelle pour détecter les polymorphismes multi-nucléotidiques sur une plateforme de manipulation de gouttelettes pneumatique. Avec la méthode proposée, l'ensemble de l'expérience, y compris la manipulation des gouttelettes et la détection de polymorphismes nucléotidiques multiples, peut être effectuée à proximité de 23 ° C, sans l'aide d'instruments avancés.
Abstract
Une méthode simple et visuel pour détecter plusieurs polymorphisme nucléotidique (MNP) a été réalisée sur une plate-forme de manipulation de gouttelettes pneumatique sur une surface ouverte. Cette approche de la détection de l'ADN colorimétrie a été basée sur la croissance d'hybridation à médiation par des sondes de nanoparticules d'or (sondes AUNP). La taille de la croissance et la configuration de la AUNP sont dominées par le nombre d'échantillons d'ADN hybridées avec les sondes. Sur la base des propriétés optiques SIZE- et dépendant de la forme spécifique des nanoparticules, le nombre de discordances dans un fragment d'ADN de l'échantillon aux sondes est en mesure d'être discriminé. Les tests ont été effectués par l'intermédiaire de gouttelettes contenant des réactifs et des échantillons d'ADN, respectivement, et ont été transportés et mélangés sur la plateforme pneumatique avec l'aspiration pneumatique contrôlée de la membrane superhydrophobe à base de PDMS flexibles. Gouttelettes peuvent être fournis simultanément et précisément sur une surface ouverte sur la plateforme pneumatique proposée qui est hautement biocompatible sans eff latéralect d'échantillons d'ADN à l'intérieur des gouttelettes. En combinant les deux méthodes proposées, le polymorphisme multi-nucléotide peut être détectée à la vue sur le pneumatique plate-forme de manipulation de gouttelettes; aucun instrument supplémentaire est nécessaire. La procédure de montage des gouttelettes sur la plate-forme pour le résultat final prend moins de 5 minutes, beaucoup moins qu'avec les méthodes existantes. En outre, cette approche combinée de détection MNP nécessite un volume d'échantillon de seulement 10 ul dans chaque opération, ce qui est notablement inférieure à celle d'un système de macro.
Introduction
Polymorphisme nucléotidique (SNP), qui est d'une seule différence dans une séquence d'ADN de paires de bases, est l'un des variations génétiques les plus courantes. Les études actuelles indiquent que les SNP sont associés à un risque de maladie, l' efficacité des médicaments et les effets secondaires des individus en affectant la fonction des gènes. 1,2 Des études récentes ont également révélé que les mutations à deux ou multi-points (multi-nucleotide polymorphism) provoquent des maladies et individuelles particulières différences dans les effets de la maladie. 3,4 La détection du polymorphisme nucléotidique est donc impératif de prescreening maladie. Des méthodes simples et efficaces pour la détection rapide des oligonucléotides spécifiques de la séquence ont été très développées au cours des deux dernières décennies. 1,5 Les approches actuelles pour identifier les mutations de l' ADN impliquent généralement des procédures , y compris la sonde immobilisation, marquage par fluorescence, électrophorèse sur gel, etc., 6,7 mais ces méthodes nécessitent généralement un processus d'analyse long, expenéquipements sive, techniciens bien formés, et la consommation importante d'échantillons et de réactifs.
Une nanoparticule avec un grand rapport de la surface au volume et propriétés physico-chimiques uniques est un matériau idéal en tant que plate-forme de détection très sensible et pas cher pour des biomarqueurs spécifiques. Les nanoparticules d'or (AUNP) sont largement utilisés pour la détection de l' ADN en raison de leur grande capacité à être modifiée avec des sondes oligonucléotidiques. 8-10 techniques de détection de SNP ont également été développés en utilisant AUNP. 11-13 Dans ce travail , nous avons adopté une approche colorimétrique roman pour détecter la plusieurs polymorphisme nucléotidique (MNP) par croissance d'hybridation à médiation par l' ADN de sondes AUNP 14. Cette méthode de sondage simple et rapide est basé sur la théorie selon laquelle les différentes longueurs d'ADN simple brin (ADNsb) ou de l' ADN double brin (ADNdb) conjugué à AUNP influencer la taille de la croissance et la forme du AUNP (voir Figure 1). 15 Cette méthode de détection de l' ADNdispose d'une faible consommation de réactifs, une petite durée de l'essai (quelques minutes), et une procédure simple, sans contrôle thermique qui est applicable à l'avenir pour le diagnostic clinique et un examen médical interne.
Plusieurs systèmes microfluidiques pour détecter la séquence d'ADN ont été développés; 16 ces systèmes microfluidiques, évolué à partir de protocoles expérimentaux traditionnels, besoin de moins de pièces d'équipement à grande échelle et simplifié les protocoles expérimentaux afin d'améliorer la sensibilité, limite de détection et la spécificité de l'ADN biocapteur. Les méthodes de détection de l' ADN dans les systèmes microfluidiques nécessitent encore, cependant, les instruments d'un processus ultérieur tel qu'une PCR (réaction en chaîne par polymérase) Machine pour l' amplification de signal et un lecteur de fluorescence pour une seule lecture pour identifier le SNP hétérogène. 17,18 Développement simple plateforme sans traitement ultérieur pour lire directement les résultats de multi-nucléotide polymorphismeest hautement souhaitable. Comparé à bien utilisé, classique, fermé des systèmes microfluidiques, la surface ouverte des dispositifs microfluidiques offrent promisingly plusieurs avantages, comme une voie claire optique, un moyen facile d'accéder à l'exemple, un accès direct sur l'environnement et la cavitation pas facilement formé ou une obstruction interfaciale dans le canal. 19 Nos travaux antérieurs mis en place une plate – forme pneumatique simple pour la manipulation ouverte de la surface des gouttelettes (voir la figure 2). 20 Sur cette plate – forme, les gouttelettes peuvent être transportées simultanément et manipulées sans interférence à partir d' une énergie d' entraînement en utilisant une force d'aspiration, qui a une un grand potentiel dans les applications biologiques et chimiques. Cette plate-forme pneumatique a donc été utilisée pour exécuter la manipulation d'échantillons d'ADN pour la détection MNP en combinaison avec l'approche colorimétrique en utilisant le concept de croissance d'hybridation médiée par l'ADN de sondes AUNP.
Le protocole présenté dans le présent document décritune détection visuelle simple de polymorphismes multi-nucléotidiques sur le pneumatique plate-forme de manipulation de gouttelettes sur une surface ouverte. Ce travail confirme que multi-nucléotide polymorphisme est détectable à l'œil nu; la plate-forme pneumatique proposé est adapté pour des applications biologiques et chimiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, une méthode colorimétrique simple pour détecter MNP peut être mis en oeuvre à des concentrations allant de 0.11-0.50 uM dans des tubes de microcentrifugation. En outre, la méthode de détection MNP proposé est réalisé sur une plate-forme de manipulation de gouttelettes de pneumatique qui a un fort potentiel pour le criblage de l'ADN et d'autres applications biomédicales. En pratique, la plage détectable de la concentration d'ADN de l'échantillon dépend de l'efficacité…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.
Materials
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5 -end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
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