Rekabetçi Nakli Hematopoetik Kök Hücre Fitness değerlendirin
Summary
This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
Abstract
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
Introduction
Hematopoiezis yaralanma, radyasyon ve hücre ölümü ile kaybolmuş kan hücrelerinin doldurulmasını sağlayan bir rejeneratif bir süreçtir. Bu işlem, büyük ölçüde Yetişkin kemik iliğinde bulunan hematopoietik kök hücreler (HSC) ile sağlanmaktadır. Buna ek olarak, hematopoietik kök hücreler, otoimmün bozukluklar, hematolojik malignanlıklar ve immün yetmezliği 1 terapötik amaçlar için kullanılabilir. daha iyi çoğalma genişlemesi ve ulaşmak ve nakli sonrasında alıcı kemik iliğini aşılamak için kendi yeteneği dahil olmak üzere, HSC işlevini düzenleyen mekanizmaları anlamak için bir ihtiyaç vardır. Son çalışmalar, ileriye yönelik olarak, yaklaşık% 50 saflıkta 2-4 yetişkin HSClerin ve fetal HSClerin ettirecek SLAM aile üyeleri CD150 ve CD48 dahil olmak üzere birçok hücre yüzey belirteçleri, rapor olmakla birlikte, işlevsel HSCler altın standart ölçmek için bir in vivo deney, repopulating kalır kan c yeniden kurmak için yeteneklerini belirlemekIşınlanan ev 5 ell üretimi.
In vivo klonal repopulating tahlil başlangıçta kadar ve McCulloch 6 tarafından geliştirilen ve o zamandan beri rafine ve genişletilmiştir. Başlangıçta tanımlandığı gibi, HKH'lerin kendini yenileme ve farklılaşma yoluyla yaşam boyu kan hücresi üretimini sağlamak. Işınlanan alıcıya HKH'lerin transferi Böylece ABD değerlendirmek sağlar: farklı kan hücre soylarının analizi ile (T lenfositler, B lenfositler, granülositler, monositler) ve seri transplantasyonu ile kendini yenileme kapasitelerini ayırt etme yeteneği. Tahlil genellikle HKH'lerin iki nüfusun işlevselliği ve / veya miktar karşılaştırılması yer alacağı, örneğin, tedavi veya HKH'lerin bakım veya genişleme etkileyebilecek değişik faktörlerin ile işlenmemiş olan farklı genotipleri veya hücre iki farelerin gelen hücreler kültür. Donör kimerizm, veya transfer donör HKH'lerin t katkısıO kan hücresi üretimi daha sonra hücre yüzeyi markerleri veya alıcı ya da ev sahibi donör hücreleri ayırt edecek başka yöntemler kullanılarak periferik kan akış sitometri analizi ve kemik iliği ile tespit edilebilir. En yaygın olarak kullanılan belirteçler kesinlikle aşağıda verilen örnekler için seçtiğiniz gen Ptprc veya CD45 lökosit antijen 7 için iki alleldir.
klonal repopulation tahlil rekabetçi ya da rekabetçi olmayan olabilir. bir rekabetçi olmayan bir ortamda, kontrol ve test HSC hücreleri ayrı bir alıcı farelere aktarıldı ve her hücre tipi için sonuç birbirinden bağımsız olacaktır. Rekabetçi bir ortamda, test ve kontrol hem HKH'lerin işlevi rakip HKH'lerin bir nüfusa karşı ölçülür. Burada açıklanan protokol rekabetçi bir ortam kullanır, ancak, aynı zamanda, rekabetçi olmayan durumlar için uyarlanabilir. Her iki yaklaşımın da avantajları ve sınırlamaları var ve biz detaylı olarak bunları karşılaştırmak olacaktırtartışma. Biz de nakledilen HKH'lerin sayısında hakkaniyeti sağlamak için farklı yaklaşımlar tarif seyreltme deneyi (LDA) sınırlayarak HKH'lerin ölçülmesi için tahlil adapte ve sonuçların yorumlanması için başarılı ve başarısız nakli hem de örnekler sunmak nasıl açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol bilinen rakip HKH'lerin karşı donör (test) HKH'lerin göreceli uygunluğunu değerlendirmek için tasarlanmıştır. Yarışmanın durum (kök hücre fitness ılımlı düşüşler tespit etmek için daha büyük olasılıkla) tahlil göreceli hassasiyetini arttırır ve ışınlama ve enjeksiyonu etkinliğinin için bir iç teknik kontrol sağlar. Bununla birlikte, HSC spor mutlak ölçü olarak kullanılmamalıdır; Rekabetçi sulandırma bir azalma otomatik HKH'lerin rekabet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz prosedürlerin rakam tasarımı ve gösteri yardım için Roxann Hetu-Arbour müteşekkiriz. Laboratuvarda Araştırma Cole Vakfı Geçiş ödülü tarafından desteklenen, Discovery hayır verin. Doğa Bilimleri ve Kanada'nın (NSERC) Mühendislik Araştırma Konseyi ve Kanada Yenilik Vakfı (CFI Liderler Fonu hayır. 31377 hibe) 419226-2012. Santé (FRQS) – KMH Fonds de recherche du Québec için chercheur-BOURSIER konumundadır olduğunu.
Materials
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
| 20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
| 1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
| 70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |
References
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- . Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
