Конкурентные трансплантатов для оценки гемопоэтических стволовых клеток Фитнес
Summary
This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
Abstract
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
Introduction
Кровотворение представляет собой регенеративный процесс, который обеспечивает пополнение клеток крови, которые были утрачены из-за травмы, радиации и гибели клеток. Этот процесс обеспечивается гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), которые в значительной степени проживают в костном мозге взрослого. Кроме того, гемопоэтические стволовые клетки могут быть использованы в терапевтических целях при аутоиммунных расстройств, гематологических злокачественных заболеваний и иммунодефицитных состояний 1. Существует, таким образом, необходимо, чтобы лучше понять механизмы, которые регулируют функцию HSC, включая их расширение пролиферативной и их способности достигать и прижился костный мозг получателя после пересадки. Хотя недавние исследования сообщали о нескольких маркеров клеточной поверхности, в том числе членов семьи SLAM CD150 и CD48, чтобы перспективно обогащают взрослых ГСК и плода ГСК до приблизительно 50% чистоты 2-4, золотой стандарт мера для функционального ГСК остается в естественных условиях заселив анализа на определить их способность восстановить крови грпроизводство ELL в облученном хозяина 5.
Клональная анализ заселив в естественных условиях изначально был разработан Till и McCulloch 6 и с тех пор была усовершенствована и расширена. Как первоначально определено, ГСК обеспечить пожизненную производство клеток крови через самообновлению и дифференцировке. Передача ГСК в облученного реципиента, таким образом, позволяет оценить: их способность дифференцировать на основе анализа различных линий клеток крови (Т-лимфоциты, В-лимфоциты, гранулоциты, моноциты) и их способности к самообновлению путем последовательной трансплантации. Анализ, как правило , предполагают сравнение функциональных и / или количества двух популяций ГСК, например, клетки , поступающие из двух мышей разных генотипов или клеток , которые были обработаны или необработанными с различными факторами , которые могут повлиять на сохранение или расширение ГСК в культуре. Донор химеризмом, или вклад переданы доноров ГСК тO производства клеток крови, то может быть определено с помощью проточной цитометрии в периферической крови и костного мозга с использованием маркеров клеточной поверхности или другие методы, которые отличит донорские клетки от реципиента, или хозяина. Наиболее широко используются маркеры, безусловно , два аллеля гена Ptprc или CD45 лейкоцитарного антигена 7 , которую мы выбрали для примеров , приведенных ниже.
Клональная анализ репопуляция может быть конкурентным или неконкурентным. В неконкурентной обстановке, управления и испытаний HSC, передаются на отдельные мышей-реципиентов, и результаты для каждого типа клеток будет независим от другого. В условиях конкурентной борьбы, функции и тестирования и управления ГСК измеряется против населения конкурента ГСК. Протокол, описанный здесь, использует конкурентной борьбы, но также могут быть адаптированы для неконкурентных ситуаций. Оба подхода имеют свои преимущества и недостатки, и мы сравним их подробно вобсуждение. Мы также описывают различные подходы к обеспечению справедливости в отношении количества пересаженных ГСК, объяснить, каким образом адаптировать анализ для количественного определения ГСК путем ограничения разбавления анализа (LDA), и привести примеры как успешных, так и неудачных трансплантаций для интерпретации результатов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, предназначен для оценки относительной пригодности доноров (тест) ГСК от известных конкурента ГСК. Ситуация конкуренции увеличивает относительную чувствительность анализа (что более вероятно обнаружить умеренное снижение в стволовых клеток пригодности) и о…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Roxann хету-Арбор за помощь в разработке фигуры и демонстрации процедур. Исследования, проведенные в лаборатории была поддержана Transition награду от Cole Foundation, Discovery грант №. 419226-2012 от естественных наук и инженерного исследовательского совета Канады (NSERC) и Канада Фонд инноваций (CFI Лидеры фонда грант №. 31377). KMH является Chercheur-Boursier Младший для Fonds де Recherche дю Квебек – Santé (FRQS).
Materials
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
| 20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
| 1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
| 70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |
References
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- . Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
