Transplantes competitivos para avaliar hematopoéticas aptidão Stem Cell
Summary
This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
Abstract
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
Introduction
A hematopoiese é um processo regenerativo que garante o reabastecimento das células do sangue que foram perdidos devido a uma lesão, a radiação e a morte celular. Este processo é assegurada por células estaminais hematopoiéticas (HSC), que em grande parte residem na medula óssea de adultos. Além disso, as células estaminais hematopoiéticas podem ser utilizados para fins terapêuticos em doenças auto-imunes, doenças malignas hematológicas e imunodeficiências 1. Assim, há uma necessidade de compreender melhor os mecanismos que regulam a função HSC, incluindo sua expansão proliferativa e sua capacidade de alcançar e enxertar a medula óssea receptor após o transplante. Embora estudos recentes tenham relatado vários marcadores de superfície celular, incluindo os membros da família SLAM CD150 e CD48, para enriquecer prospectivamente HSCs adultos e fetais HSCs para aproximadamente 50% de pureza 2-4, a medida padrão de ouro para hsc funcional permanece um ensaio in vivo para repovoar determinar a sua capacidade de restabelecer sangue cprodução ell em um host irradiado 5.
O ensaio de repovoamento clonal in vivo foi inicialmente desenvolvido por Till e McCulloch 6 e desde então tem sido aperfeiçoado e expandido. Tal como inicialmente definido, HSCs garantir a produção de glóbulos ao longo da vida através da auto-renovação e diferenciação. A transferência de HSCs para um destinatário irradiado permite-nos assim a avaliar: a sua capacidade de se diferenciar por meio da análise das diferentes linhagens de células sanguíneas (linfócitos T, linfócitos B, granulócitos, monócitos) e a sua capacidade de auto-renovação por transplante em série. O ensaio que geralmente envolvem a comparação da funcionalidade e / ou a quantidade de duas populações de HSCs, por exemplo, células provenientes de dois ratinhos de diferentes genótipos ou células que foram tratadas ou não tratadas com diferentes factores que podem influenciar a manutenção ou expansão de HSCs em cultura. quimerismo doador, ou a contribuição de doadores transferidos HSCs tO produção de células sanguíneas pode ser então determinada por análise de citometria de fluxo no sangue periférico e de medula óssea por meio de marcadores de superfície celular ou outros métodos que irão distinguir células dadoras do recipiente, ou hospedeiro. Os marcadores mais utilizados são certamente os dois alelos para o gene Ptprc ou antígeno CD45 leucócitos 7 que temos escolhido para os exemplos fornecidos abaixo.
O ensaio de repovoamento clonal pode ser competitiva ou não competitiva. Em uma configuração não-competitivo, de controlo e de teste HSCs são transferidos para ratinhos receptores separados e os resultados para cada tipo de célula será independente da outra. Num ambiente competitivo, a função tanto de teste e de controlo HSCs é medido contra uma população de HSCs concorrente. O protocolo descrito aqui usa a configuração competitiva, mas também pode ser adaptado para situações não-competitivas. Ambas as abordagens têm suas vantagens e limitações, e vamos compará-las em detalhe nodiscussão. Nós também descrevem abordagens diferentes para garantir a equidade no número de HSCs transplantadas, explicam como adaptar o ensaio para a quantificação de HSCs, limitando ensaio de diluição (LDA), e fornecer exemplos de ambos os transplantes de bem e mal sucedidas para a interpretação dos resultados.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito destina-se a avaliar a aptidão relativa de dadores (teste) HSCs contra competidor conhecido HSCs. A situação de concorrência aumenta a sensibilidade relativa do ensaio (maior probabilidade de detectar reduções moderadas na aptidão de células-tronco) e fornece um controle técnico interno para a eficácia da irradiação e injeção. No entanto, ele não deve ser utilizado como uma medida absoluta de HSC aptidão; uma diminuição na reconstituição competitivo não significa automatica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Roxann Hétu-Arbour para a assistência com o design figura e demonstração dos procedimentos. Pesquisa no laboratório foi apoiado por uma concessão de Transição da Fundação Cole, Descoberta conceder nenhuma. 419226-2012 das Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Investigação do Canadá (NSERC) e da Fundação Canadense para a Inovação (CFI Líderes Fundo conceder no. 31377). KMH é um Chercheur-Boursier Júnior para o Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS).
Materials
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
| 20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
| 1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
| 70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |
References
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