Визуализация ВИЧ-1 Gag Связывание с Giant однослойные везикулы (ГУВ) Мембраны

Человеческий вирус иммунодефицита типа 1 (ВИЧ-1) представляет собой оболочечный вирус, который собирает в и почки из плазматических мембран (ПМ) в большинстве типов клеток. Сборка вирусных частиц ВИЧ-1 приводится в движение с помощью вирусного белка ядра 55 кДа под названием Pr55 ^{Затычка} (ГАГ). Gag синтезируется в виде полипротеина предшественника, состоящего из четырех основных структурных доменов, а именно, матрица, капсида, нуклеокапсиде и P6, а также два распорных пептидов SP1 и SP2. Во время сборки матрица (MA) домен отвечает за нацеливание Gag к месту сборки капсида (CA) домен опосредует Gag-Gag взаимодействий, нуклеокапсида (NC) домена вербует геномной РНК вируса и P6 новобранцы принимающие факторы, которые содействуют вирус разрезка частиц из плазматической мембраны. Затычка также подвергается со-трансляционной модификации путем добавления жирной кислоты 14-углерода или миристатной фрагмента на его N-конце.

Мембрана связывание Gag является необходимым условием для вирусной сборки, так как тutants, которые имеют дефекты в мембране связывания не производят вирусные частицы. Мы и другие показали, что мембраны связывание Gag опосредуется двудольных сигналов в пределах домена Массачусетс: N-концевой миристат фрагмент, который опосредует гидрофобные взаимодействия с липидный бислой и кластером основных остатков в домене МА называется, как высоко основной области ( HBr) , который взаимодействует с кислыми липидами на ПМ ^1-4. Исследования Gag-мембранных взаимодействий с использованием эктопической экспрессии polyphosphoinositide 5-фосфатазы IV (5ptaseIV), фермент , который катализирует гидролиз PM-специфической кислой фосфолипидного phosphatidylinositol- (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P _2] к фосфатидилинозитол-4-фосфат, в клетках предположил , что локализация Gag-ПМ опосредуется PI (4,5) P ₂ ^3,5. Тем не менее, в пробирке исследования , направленные на понимание более механистические детали Gag-PI (4,5) P ₂ взаимодействия оказались быть сложным по целому ряду причин. ДляНапример, очистка полнометражных myristoylated ВИЧ-1 Затычка для биохимических экспериментов было технически сложно, по крайней мере частично из-за тенденции ГАГ агрегировать во время очистки. Следовательно, усеченные формы ВИЧ-1 Gag, такие как Myr-MA или Myr-MA-CA, или не-myristoylated форме были часто используются в исследованиях , которые требуют Gag очистки (например, ядерный магнитный резонанс, белок футпринтинга, и поверхность плазмонного резонанса ^6-9). В качестве альтернативы, в сочетании в пробирке реакций транскрипции-трансляции, были использованы для получения полной длины myristoylated ВИЧ-1 кляп в других биохимических исследований ^1,2. Как правило , в этой системе, плазмиду Затычка-кодирование транскрибировать и транслировать с эукариотические лизаты клеток (например, кролик лизатов ретикулоцитов), которые лишены каких – либо клеточных мембран и с матричными РНК , но содержат механизм для транскрипции и трансляции. После реакции, клеточные лизаты, содержащие Gag смешиваются со мнойmbranes для анализа Gag взаимодействий с липидами. В дополнение к легкости приготовления полной длины myristoylated Затычка, методы , использующие систему перевода в пробирке транскрипции имеют преимущество , что синтез Затычка и последующее мембранные реакции связывания происходят в 'эукариотической цитозоле типа "среды , которая может лучше представлять физиологических условиях. Это свойство способствовало исследований , которые показали , что молекулы РНК , связанные с доменом MA регулируют Gag связывания с кислыми липидов на конкурентной основе ^1,2,10-12. Тем не менее, так как общее количество Gag белков, полученных в этих клеточных лизатов не высоки, метаболическое мечение белков с радиоактивно меченных аминокислот необходимо для их обнаружения.

В зависимости от метода измерения Затычка-липидных взаимодействий, которые были использованы разнообразные мембранных препаратов. Каждый из этих методов имеет свои достоинства и недостатки. Большинство анализов ЯМР на основе требуют использования липидов с коротким ацилцепи , которые растворимы в воде (например, С4 и С8-PI (4,5) P ₂₎ ^6,8. В то время как ЯМР – методы тестирования связывание Gag с липидами , которые имеют длинные ацильные цепи , найденные в клетках на стадии разработки, они были использованы только с myristoylated или nonmyristoylated MA до сих пор ^8,13. В качестве альтернативы, липосомы , приготовленные из липидов , которые имеют родные длины ацильных цепей были использованы в биохимических методов , таких как липосомы флотацией или флуоресцентного липосомного буртика анализы связывания ^{2,3,10,14-16.} Тем не менее, липосомы, используемые в этих анализах имеют небольшие диаметры, и, таким образом, их мембраны имеют крутые и положительную кривизну. В противоположность этому, на ранней стадии сборки частиц ВИЧ-1-инфицированных клеток, Gag связывается с ПМ, который почти Planar по шкале Gag, а затем вызывает отрицательную кривизну во время бутонизации. Таким образом, мембраны липосом с крутыми и положительной кривизны не может быть идеальным липидные двухслойные для изучения Gag-липидных взаимодействий. Что касается липосом FlotAtion анализы, еще один потенциальный нюанс в том, что воздействие Gag-липидных комплексов до гипертонического градиент сахарозы во время центрифугирования может повлиять на экспериментальный результат. Чтобы смягчить эти ограничения и предоставить дополнительную экспериментальную систему, анализы для Gag связывания с гигантскими однослойные везикулы (GUVs) были разработаны в последние годы. GUVs единичные липидный бислой везикул, диаметр которых распространяется на несколько десятков микрометров. Таким образом, кривизна этих мембран напоминает ПМ по шкале Gag. Кроме того, из-за его большого размера, что позволяет визуальный осмотр под оптическим микроскопом, мембрана связывание флуоресцентно помеченная или меченых белков Gag этих везикул при смешивании можно легко определить без последующей обработки Gag-липидных комплексов.

Мы здесь опишем протокол для изучения ВИЧ-1 Gag мембрану связывания с использованием GUVs, полученные из метода electroformation. Различные методы, такие как нежный гидратации, гель-помощь гидратации, микрофонrofluidic струйное и electroformation ^17-22 были использованы для получения GUVs. Для протокола, описанного здесь, метод electroformation используется в первую очередь из-за его эффективности в формировании GUVs с кислыми липидами и его относительной простоте использования без необходимости дорогостоящих установок. Поскольку визуализация Gag требует флуоресцентного репортеру, желтый флуоресцентный белок (YFP) генетически добавлен к С-концу Gag (ГАГ-YFP). Gag-YFP белки получают в пробирке транскрипции и трансляции реакций в зародышей пшеницы лизатов на основе технологии непрерывного обмена-непрерывным потоком (CECF). В этой технологии, как удаление ингибирующих побочных продуктов реакции и операции подачи субстратов реакции и энергетических компонентов достигаются в механизме диализной основе. Для этих реакций, используют плазмиду, кодирующую Gag-YFP под контролем промотора Т7. Следует отметить, что, как было показано ранее, зародыши пшеницы лизаты поддерживают миристоилированию без дополнительных компонентов ²3,24. Используя этот метод, удалось получить достаточное количество полнометражных myristoylated Gag-YFP для визуализации Gag на ГУВ мембран ^24. Здесь мы опишем протокол , с которым ВИЧ-1 Gag связывания с PI (4,5) P ₂ -содержащие ГУВ мембраны могут быть рассмотрены без длительной последующей обработки следующие реакции связывания и предполагают , что этот метод дополняет существовавшие ранее Gag-мембраны анализов связывания и может быть расширен для более глубокого понимания связывания ВИЧ-1 Gag-мембрану.