تصور HIV-1 الكمامة ملزم لالعملاق Unilamellar الحويصلة (GUV) الأغشية
Summary
We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.
Abstract
البروتين الهيكلي للHIV-1، Pr55 الكمامة (أو الكمامة)، بربط غشاء البلازما في الخلايا أثناء عملية التجميع الفيروس. غشاء ملزمة من الكمامة هو خطوة أساسية لتكوين جسيمات الفيروس، منذ وجود خلل في نتائج ملزمة غشاء الكمامة في انخفاض حاد في إنتاج الجسيمات الفيروسية. للحصول على تفاصيل الميكانيكية للتفاعلات غشاء الكمامة-الدهون، في المختبر أساليب تعتمد على الرنين المغناطيسي، البصمة البروتين، سطح مأكل الرنين، الطرد المركزي الحويصلية التعويم، أو حبة مضان الدهون ملزمة تم وضعها حتى الآن. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب في المختبر لها حدودها. للتغلب على بعض هذه القيود وتوفير نهج متكامل لطرق المحددة سابقا، قمنا بتطوير فحص في المختبر الذي التفاعلات بين HIV-1 الكمامة والأغشية الدهنية تتم في بيئة "تشبه الخلايا". في هذا الاختبار، الكمامة ملزمة لالأغشية الدهنية وبصريا تحليلها باستخدام YFP-taggeد الكمامة توليفها في القمح الجرثومية والتى ترتكز في نظام الترجمة المختبر وGUVs بواسطة تقنية electroformation أعد. نحن هنا وصف الخلفية وبروتوكولات للحصول على myristoylated كامل طول البروتينات الكمامة والأغشية GUV اللازمة للفحص والكشف عن الكمامة-GUV ملزمة بواسطة المجهر.
Introduction
نقص المناعة البشري نوع الفيروس 1 (HIV-1) هو فيروس يلفها أن تجمع في والبراعم من غشاء البلازما (بعد الظهر) في معظم أنواع الخلايا. هو الدافع وراء تجميع جزيئات الفيروس HIV-1 من 55 كيلو دالتون البروتين الأساسية فيروسي يسمى Pr55 الكمامة (الكمامة). ويتم تصنيع هفوة كما polyprotein السلائف تتألف من أربعة مجالات هيكلية رئيسية، وهي مصفوفة، القفيصة، قفيصة منواة، وP6، وكذلك الببتيدات اثنين فاصل SP1 و SP2. وخلال الاجتماع، ومصفوفة (MA) للنطاق هو المسؤول عن استهداف الكمامة إلى موقع التجمع، قفيصة (CA) نطاق يتوسط التفاعلات الكمامة الكمامة، وقفيصة منواة (NC) نطاق المجندين RNA الجيني الفيروسي، والعوامل المضيفة P6 المجندين أن المعونة فيروس الجسيمات انفصال من غشاء البلازما. كما يخضع هفوة تعديل المشارك متعدية من خلال إضافة الأحماض الدهنية-14 الكربون أو شاردة ميريستات في دورته N-محطة.
غشاء ملزمة من الكمامة شرط أساسي لتجميع الفيروسي، منذ مترutants التي هي معيبة في غشاء ملزمة تفشل في إنتاج جزيئات الفيروس. نحن وآخرون قد أظهرت أن غشاء ملزمة من الكمامة بوساطة إشارات ثنائية في مجال MA: شاردة ميريستات N-الطرفية التي تتوسط التفاعلات الطاردة للماء مع طبقة ثنائية الدهون ومجموعة من بقايا الأساسية في المجال MA توصف بأنها المنطقة الأساسية للغاية ( دورية هارفارد) التي تتفاعل مع الدهون الحمضية على رئيس الوزراء 1-4. دراسات الكمامة غشاء التفاعلات باستخدام التعبير خارج الرحم من polyphosphoinositide 5 الفوسفاتيز الرابع (5ptaseIV)، وهو الإنزيم الذي يحفز التحلل من phosphatidylinositol- فوسفورية الحمضية PM محددة (4،5) -bisphosphate [PI (4،5) ف 2] لفوسفتيدلينوستول-4-الفوسفات، في الخلايا اقترح أن الكمامة-PM توطين بوساطة PI (4،5) ف 2 3،5. ومع ذلك، في الدراسات المختبرية التي تهدف إلى فهم المزيد من التفاصيل الميكانيكية للالكمامة-PI (4،5) ف أثبتت 2 التفاعلات ليكون تحديا لعدد من الأسباب. إلىسبيل المثال، كان تنقية كامل طول myristoylated HIV-1 الكمامة لإجراء التجارب الكيميائية الحيوية الصعب من الناحية الفنية على الأقل جزئيا بسبب ميل الكمامة لتجميع خلال تنقية. وبالتالي، أشكال اقتطاع من HIV-1 الكمامة، مثل MYR-MA أو MYR-MA-CA، أو شكل غير myristoylated تم يكثر استخدامها في الدراسات التي تتطلب تنقية الكمامة (على سبيل المثال، الرنين المغناطيسي النووي والبروتين البصمة، والسطحية مأكل صدى 6-9). بدلا من ذلك، بالإضافة إلى ردود فعل النسخ الترجمة المختبر قد استخدمت لانتاج كامل طول myristoylated HIV-1 الكمامة في الدراسات البيوكيميائية أخرى 1،2. عادة في هذا النظام، يتم نسخه البلازميد الكمامة ترميز وترجمتها مع لست] خلية حقيقية النواة (على سبيل المثال، لست] أرنب الخلايا الشبكية) أن تخلو من أي الأغشية الخلوية والرنا المرسال ولكنها تحتوي على آلات النسخ والترجمة. بعد رد الفعل، لست] الخلية التي تحتوي الكمامة تختلط معيmbranes لتحليل التفاعلات الكمامة مع الدهون. بالإضافة إلى سهولة إعداد كامل طول myristoylated الكمامة، وأساليب استخدام في المختبر نظام الترجمة النسخ لديها ميزة أن التوليف الكمامة وردود الفعل ملزمة غشاء لاحق تحدث في "حقيقيات النوى مثل العصارة الخلوية 'الوسط التي قد تمثل أفضل الظروف الفسيولوجية. وساهمت هذه الخاصية إلى الدراسات التي أظهرت أن جزيئات الحمض النووي الريبي بد أن المجال MA تنظم الكمامة ملزم الدهون الحمضية بطريقة تنافسية 1،2،10-12. ومع ذلك، منذ المبلغ الإجمالي من البروتينات الكمامة التي تم الحصول عليها في هذه الخلية لست] ليست عالية، ووضع العلامات التمثيل الغذائي للبروتينات مع الأحماض الأمينية رديولبلد ضروري للكشف عنها.
اعتمادا على طريقة لقياس التفاعلات الكمامة-الدهون، وقد استخدمت مجموعة متنوعة من الاستعدادات الغشاء. كل من هذه الطرق لها قوتها والقيود. تتطلب معظم فحوصات الرنين المغناطيسي النووي استنادا-استخدام الدهون مع أسيل قصيرةالسلاسل التي هي للذوبان في الماء (على سبيل المثال، C4- وC8-PI (4،5) ف 2) 6،8. بينما الأساليب الرنين المغناطيسي النووي لاختبار ملزمة من الكمامة على الدهون التي لديها سلاسل أسيل طويلة وجدت في خلايا يجري تطويرها، وأنها لم تستخدم إلا مع MA myristoylated أو nonmyristoylated حتى الآن 8،13. بدلا من ذلك، تم استخدام الجسيمات الشحمية المحضرة من الدهون التي لديها سلاسل طول أسيل الأم في الطرق الحيوية مثل تعويم الحويصلية أو الفلورسنت الحويصلية حبة المقايسات ملزمة 2،3،10،14-16. ومع ذلك، الجسيمات الشحمية المستخدمة في هذه المقايسات لها أقطار صغيرة، وبالتالي الأغشية يكون انحناءات حادة وإيجابية. في المقابل، خلال المرحلة المبكرة من تجميع الجسيمات في الخلايا المصابة HIV-1، الكمامة بربط PM، التي مستو تقريبا على مقياس من الكمامة، وبعد ذلك يدفع انحناء سلبي خلال مهدها. لذلك، قد الأغشية الحويصلية مع انحناء حاد وإيجابي لا تكون طبقات ثنائية الدهون مثالية لدراسة التفاعلات الكمامة الدهون. أما بالنسبة FLOT الحويصليةالمقايسات أوجه، التحذير محتمل آخر هو أن التعرض المجمعات الكمامة-الدهون إلى التدرج السكروز مفرط التوتر أثناء الطرد المركزي قد تؤثر على نتائج تجريبية. لتخفيف هذه القيود وتوفير نظام تجريبي مكملة، تم وضع المقايسات لالكمامة ملزمة لالحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) في السنوات الأخيرة. GUVs هي واحدة الحويصلات الدهون طبقة ثنائية التي تمتد إلى عدة عشرات ميكرومتر الأقطار. وهكذا، فإن انحناء هذه الأغشية يشبه PM على مقياس من الكمامة. وعلاوة على ذلك، نظرا لحجمها الكبير، والتي تمكن الفحص البصري تحت المجاهر الضوئية، غشاء ملزمة البروتينات الكمامة من الموسومة fluorescently أو المسمى لهذه الحويصلات على أن تحدد بسهولة من دون معالجة لاحقة من المجمعات الكمامة-الدهون خلط.
نحن هنا وصف البروتوكول لدراسة HIV-1 الكمامة غشاء ملزمة باستخدام GUVs تم الحصول عليها من طريقة electroformation. أساليب مختلفة مثل ترطيب لطيف، بمساعدة جل الترطيب، هيئة التصنيع العسكريوقد استخدمت النفث rofluidic، وelectroformation 17-22 للحصول على GUVs. لبروتوكول الموصوفة هنا، يتم استخدام طريقة electroformation في المقام الأول بسبب كفاءتها في تشكيل GUVs مع الدهون الحمضية وسهولة النسبية للاستخدام دون الحاجة إلى الاجهزة باهظة الثمن. منذ التصور من الكمامة يستوجب مراسل فلوري، يضاف الأصفر بروتين فلوري (YFP) وراثيا إلى C-محطة من الكمامة (GAG-YFP). ويتم الحصول على البروتينات هفوة-YFP من النسخ في المختبر والترجمة ردود الفعل في لست] جرثومة القمح على أساس تدفق التكنولوجيا التبادل المستمر مستمرة (CECF). في هذه التكنولوجيا، وتتحقق على حد سواء إزالة المخلفات المثبطة لردود الفعل وتوريد ركائز التفاعل ومكونات الطاقة في آلية القائم على غسيل الكلى. لردود الفعل هذه، يتم استخدام ترميز البلازميد الكمامة-YFP تحت سيطرة أحد المروجين T7. وتجدر الإشارة، كما هو مبين في وقت سابق، لست] جرثومة القمح تدعم myristoylation دون مكونات إضافية 23،24. باستخدام هذه الطريقة، فقد كان من الممكن الحصول على كميات كافية من كامل طول myristoylated الكمامة-YFP لرؤية الكمامة على الأغشية GUV 24. نحن هنا تصف البروتوكول الذي HIV-1 الكمامة ملزمة لPI (4،5) ف 2 المحتوية على الأغشية GUV يمكن دراستها دون معالجة لاحقة طويلة بعد ردود الفعل ملزمة وأقترح أن هذه الطريقة يكمل قبل الإيجاد الكمامة غشاء المقايسات ملزمة ويمكن أن يكون مدد لمزيد من فهم HIV-1 الكمامة غشاء ملزمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقايسة ملزمة GUV على النحو المبين أعلاه يوفر بديلا جيدا في سيناريوهات حيث لديها أخرى المقايسات التفاعل البروتين الدهني حدودها. هذا الاختبار يسمح لنا لدراسة التفاعلات بين myristoylated الكمامة كامل طول والدهون الحمضية مع سلاسل أسيل طول الأم في سياق الدهون طبقة ثنائية وتفعل …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر محمد سليم، جينغ وو وكريشنان هوناتان لإجراء مناقشات مفيدة. كما نشكر بريا Begani للمساعدة أثناء التصوير. ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 AI071727 (لAO) وR01 GM110052 (إلى السلفادور).
Materials
| Digital Multimeter | Meterman | 30XR | A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose. |
| Function Generator | Instek | GFG-8216A | A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient. |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubator | Hoefer | Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient | |
| Vacuum chamber | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Syringe | Hamilton | 80400 | Gauge 22S, Syringe number 702 |
| PDMS | Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning | Sylgard, 184 | |
| RTS 100 Wheat Germ CECF Kit | BiotechRabbit, Berlin, Germany |
BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipids | 840046X |
References
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).
- Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).
- Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).
- Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).
- Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
- Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochemistry. 45 (13), 4077-4083 (2006).
- Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).
- Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochemistry. 49 (25), 5109-5116 (2010).
- Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).
- Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).
- Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5 (6), e02202 (2014).
- Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18 (1), 9-16 (2010).
- Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).
- Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).
- Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochemistry. 27 (13), 4668-4673 (1988).
- Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).
- Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).
- Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
- Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
- Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).
- Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).
- Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).
- Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).
