Visualisatie van HIV-1 Gag Binding aan Giant Unilamellaire bolletjes (GUV) Membranen

Humaan immunodeficiëntievirus type 1 (HIV-1) is een omhuld virus dat assembleert op en knoppen van de plasmamembraan (PM) in de meeste celtypen. Het samenstel van HIV-1 virusdeeltjes wordt aangedreven door de 55 kDa viruskern eiwit Pr55 ^Gag (Gag). Gag wordt gesynthetiseerd als een precursor polyeiwit uit vier belangrijke structurele domeinen, namelijk matrix, capside, nucleocapside, en p6, evenals twee afstandhouder peptiden SP1 en SP2. Bij de montage, de matrix (MA) domein is verantwoordelijk voor het richten van Gag aan de plaats, het capside (CA) domein bemiddelt Gag-Gag interacties, het nucleocapside (NC) domein werft viraal genoom RNA en p6 rekruten gastheer factoren die steun virusdeeltje splitsing van het plasmamembraan. Gag ondergaat een co-translationele modificatie door de toevoeging van een 14-koolstof vetzuur of myristaat deel aan zijn N-terminus.

Membraanbinding van Gag is een essentiële voorwaarde voor de virale assemblage, aangezien mutants dat defect is in membraan binding zijn niet aan virusdeeltjes te produceren. Wij en anderen hebben aangetoond dat membraanbinding van Gag wordt gemedieerd door tweedelige signalen in de MA domein: het N-terminale myristaat groep die hydrofobe wisselwerkingen medieert de lipide bilaag en een cluster van basische resten in de MA domein aangeduid als zeer basisgebied ( HBR) die interageert met zure lipiden op de PM ^1-4. Studies van Gag-membraaninteracties behulp ectopische expressie van polyphosphoinositide 5-fosfatase IV (5ptaseIV), een enzym dat de hydrolyse van PM-specifieke zure fosfolipiden phosphatidylinositol- katalyseert (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) _P2] aan fosfatidylinositol-4-fosfaat, in cellen suggereerde dat Gag-PM lokalisatie wordt gemedieerd door PI (4,5) _P2 ^3,5. In vitro studies uitvoeren om meer inzicht mechanistische informatie van Gag-PI (4,5) _P2 interacties bewezen uitdagend om een aantal redenen. VoorZo is zuivering van volledige lengte gemyristoyleerde HIV-1 Gag biochemische experimenten technisch moeilijk ten minste gedeeltelijk als gevolg van de neiging van Gag te aggregeren tijdens de zuivering. Derhalve afgeknotte vormen van HIV-1 Gag, zoals Myr-MA of Myr-MA-CA, of niet-gemyristoyleerde vorm zijn veelvuldig bij studies die Gag zuivering vereisen (bijvoorbeeld kernmagnetische resonantie, eiwitten footprinting en oppervlak plasmon resonance ^6-9). Als alternatief gekoppelde in vitro transcriptie-translatie reacties zijn gebruikt om full-length gemyristoyleerde HIV-1 Gag in andere biochemische studies ^1,2 produceren. Typisch in dit systeem wordt een Gag-coderende plasmide getranscribeerd en getranslateerd met eukaryote cellysaten (bijvoorbeeld konijn reticulocyten-lysaten) die zonder enige celmembranen en messenger RNAs zijn maar bevatten de machines voor transcriptie en translatie. Na de reactie worden cellysaten bevattende Gag gemengd met membranes voor de analyse van de Prop van de interacties met lipiden. Naast het gemak van het bereiden van volledige lengte gemyristoyleerde Gag, methoden waarbij de in vitro transcriptie translatiesysteem een voordeel dat Gag synthese en daaropvolgende membraan bindingsreacties plaatsvinden in een 'eukaryote cytosol-achtige "milieu die beter kunnen vormen fysiologische omstandigheden. Deze eigenschap heeft bijgedragen aan de studies waaruit bleek dat RNA-moleculen gebonden aan de MA-domein te reguleren Gag binding aan zure lipiden in een competitieve manier ^1,2,10-12. Aangezien de totale hoeveelheid eiwitten verkregen Gag deze cellysaten zijn niet hoog, metabolisch merken van eiwitten met radioactief gemerkte aminozuren nodig voor de signalering.

Afhankelijk van de methode Gag-lipide interacties te meten, hebben diverse membraan preparaten gebruikt. Elk van deze methoden heeft zijn sterke en zwakke punten. De meeste NMR-gebaseerde testen vereisen het gebruik van lipiden met korte acylgroepketens die in water oplosbare (bijvoorbeeld C4 en C8-PI (4,5) _P2) ^6,8 zijn. Terwijl NMR methoden voor binding van Gag testen om de lipiden die lange acylketens in cellen ontwikkeld hebben, zijn zij gebruikt alleen of gemyristoyleerde nonmyristoylated MA dusver ^8,13. Als alternatief hebben liposomen bereid van lipiden die inheemse lengte acylketens zijn gebruikt in biochemische methoden, zoals liposoom beursgang of fluorescerende liposoom bead bindingstesten ^{2,3,10,14-16.} Echter, liposomen gebruikt in deze testen hebben kleine diameters, en zo hun membranen steile positieve krommingen. Daarentegen, tijdens de vroege fase van deeltjes samenstel in HIV-1-geïnfecteerde cellen, Gag bindt aan de PM, die nagenoeg planair is op de schaal van Gag en vervolgens induceert negatieve kromming tijdens dop. Daarom zou liposoom membranen met steile en positieve kromming niet ideaal lipidendubbellagen aan Gag-lipide interacties te bestuderen. Zoals voor liposoom flotatie testen andere potentiële nadeel is dat blootstelling van Gag-lipidecomplexen hypertone sucrosegradiënt centrifugatie kan tijdens de experimentele resultaat beïnvloeden. Om deze beperkingen te verlichten en een aanvullend experimenteel systeem, zijn assays voor Gag binding aan grote unilamellaire vesicles (GUVs) zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren. GUVs zijn enkele lipide dubbellaag vesicles waarvan de diameters vergroten tot enkele tientallen micrometers. Dus de kromming van deze membranen lijkt de PM op de schaal van Gag. Bovendien, vanwege de grote omvang, die visuele inspectie mogelijk maakt onder Optische microscopen, membraan binding van fluorescent gelabeld of gemerkt Gag proteïnen deze blaasjes na mengen kan gemakkelijk worden bepaald zonder verdere behandeling van Gag-lipidecomplexen.

We beschrijven hier een protocol bij HIV-1 Gag membraan binding met behulp van GUVs verkregen uit een electroformation methode te bestuderen. Verschillende methoden zoals zachte hydratatie-gel bijgestaan ​​hydratatie, microfluidic jetting en electroformation ^17-22 zijn gebruikt om GUVs verkrijgen. Voor de hier beschreven protocol, wordt de electroformation methode vooral vanwege zijn efficiëntie bij het vormen GUVs met zure lipiden en het relatieve gemak van gebruik zonder de noodzaak van dure opstellingen. Aangezien visualisatie van Gag vereist een fluorescerende reporter wordt geel fluorescerend eiwit (YFP) genetisch toegevoegd aan de C-terminus van Gag (Gag-YFP). Gag-YFP eiwitten verkregen door in vitro transcriptie en translatie reacties tarwekiemen lysaten basis van de voortdurende uitwisseling continue stroom (CECF) technologie. In deze techniek, zowel verwijderen van remmende bijproducten van de reacties en de levering van de reactie substraten en energiecomponenten worden bereikt in een dialyse-gebaseerde mechanisme. Voor deze reacties, wordt een plasmide coderend Gag-YFP onder de controle van een T7 promoter gebruikt. Van de nota, zoals eerder aangegeven, tarwekiemen lysaten ondersteunen myristoylatie zonder extra componenten ²3,24. Deze methode is het mogelijk om voldoende hoeveelheden full-length gemyristoyleerde Gag-YFP voor visualisatie van Gag op GUV membranen ²⁴ te verkrijgen. Hier beschrijven we het protocol waarmee HIV-1 Gag binding aan PI (4,5) _P2 bevattende GUV membranen kan worden onderzocht zonder langdurige verdere verwerking volgende bindende reacties en voor te stellen dat deze methode een aanvulling op reeds bestaande Gag-membraan binding assays en kan uitgebreid tot verder te begrijpen HIV-1-Gag-membraan bindend.