بروتوكول التحويل المباشر من الفئران الجنينية الخلايا الليفية إلى الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية
Summary
Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.
Abstract
خلايا الأرومة الغاذية الجذعية (TSCS) النافذة تنشأ نتيجة للأول قرار مصير خلية في التنمية الثدييات. أنها يمكن تربيتها في المختبر، والإبقاء على القدرة على وعلى التمايز إلى جميع أنواع فرعية من سلالة الأرومة الغاذية، أي ما يعادل في الجسم الحي الجذعية السكان الخلية مما أدى إلى الجزء الجنين من المشيمة تجديد الذات. لذلك، TSCs تقدم نموذجا فريدا لدراسة تطور المشيمة والجنينية مقابل خارج الجنينية قرار مصير الخلايا في المختبر. من مرحلة الكيسة الأريمية فصاعدا، حاجز جينية مميزة تتكون من الحامض النووي وهيستون التعديلات يفصل بإحكام على حد سواء الأنساب. هنا، نحن تصف بروتوكول للتغلب على هذا الحاجز بشكل كامل النسب التي كتبها عابر الإفراط في التعبير من الأرومة الغاذية المنظمين الرئيسيين Tfap2c، Gata3، Eomes وEts2 في الخلايا الليفية الجنينية في الفئران. الخلايا الجذعية المستحثة الأرومة الغاذية قادرة على تجديد الذات وتكاد تكون متطابقة إلى الكيسة المستمدة خلايا الأرومة الغاذية الجذعية طحيث ن من التشكل، التعبير الجيني علامة ونمط مثيلة. وظيفية في المختبر، وفي المقايسات فيفو تأكيد أن هذه الخلايا قادرة على التفريق على طول نسب الأرومة الغاذية توليد الخلايا العملاقة الأرومة الغاذية المتعددة الصبغيات وchimerizing المشيمة عند حقنه في الكيسات الأريمية. تحريض خلايا الأرومة الغاذية الجذعية من الأنسجة الجسمية يفتح آفاقا جديدة لدراسة الخصائص الجينية وجينية من هذه النسب من خارج الجنينية وتوفر إمكانية لتوليد خطوط الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية دون تدمير الجنين منها.
Introduction
في الآونة الأخيرة، فقد كشفت دراسة مقارنة عدة طرق من الفأرة الخلايا الجذعية الجنينية إلى الأرومة الغاذية تحويل الخلايا الجذعية التي في جميع الأنظمة تحليلها، ظل تحويل النسب غير مكتملة. بدلا من خلايا الأرومة الغاذية الجذعية المستحثة (iTSCs) يسمى الأرومة الغاذية الجذعية تم إنشاء خلايا تشبه الخلايا الإبقاء على ذكرى مصير خلية من أصل 1. هنا، نحن اتباع نهج مختلف من جيل ITSC. على غرار تحريض مباشر من الخلايا الجذعية المحفزة من الخلايا الليفية الجنينية الفئران (MEFS) 2، iTSCs تم تحويلها مباشرة من الأنسجة الجسمية متباينة. أولا، حددنا 12 عاملا مرشح حمل TSC مصير عندما overexpressed في MEFS. في وقت لاحق، وقد تم تحديد العوامل Tfap2c، Gata3، Eomes وEts2 ضرورية وكافية لتحريض ITSC 3. في وقت واحد، ومجموعة أخرى وجدت بشكل مستقل Tfap2c، Gata3 وEomes أن تكون كافية لتحويل MEFS إلى iTSCs. ومع ذلك، في هذاالدراسة، والوقت المطلوب للتعبير التحوير وقتا أطول بكثير مقارنة دراستنا، مشيرا إلى حركية تحويل مختلفة، عندما Ets2 غائبة عن transdifferentiation كوكتيل 4.
التقليدية مصل بقري جنيني (FBS) التي تحتوي على ثقافة الكيسة الخلايا الجذعية المشتقة الأرومة الغاذية التي يسببها وتعتمد على وجود عوامل التي يفرزها MEFS المعطل نمو 5،6. خلال تحريض ITSC، يتم توفير هذه العوامل التي MEFS، التي تفتقر إلى مجموعة كاملة من الجينات المحورة ولا يخضعون transdifferentiation. ومع ذلك، المستعمرات ITSC مرة واحدة الفردية هي شبه مثقف، فإنها تتطلب وسائل الإعلام، والتي تم شروطا مسبقة قبل MEFS المعطل النمو. من هناك على، يمكن iTSCs يكون مثقف وتعامل مثل الكيسة المستمدة TSCs وفقا لبروتوكولات موحدة. وتجدر الإشارة، على النقيض من تاناكا وآخرون. 5، ونحن بشكل روتيني ثقافة TSCs وiTSCs دون الهيلمة أطباق زراعة الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
4 عامل (Tfap2c، Gata3، Eomes، Ets2) بروتوكول transdifferentiation مقرها المقدمة هنا يوفر طريقة يمكن الاعتماد عليها لتوليد بأمانة تحويلها iTSCs من الخلايا الليفية الماوس الجنينية. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة أيضا ينطبق على الخلايا الليفية الذيل بعد الولادة، على الرغم من انخفاض في كفاءة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
