Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen
Summary
Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.
Abstract
Trofoblast stamcellen (TSC) ontstaan als gevolg van de eerste Celgedrag in de ontwikkeling van zoogdieren. Ze kunnen in vitro worden gekweekt, het vermogen behouden om te hernieuwen en om te differentiëren in alle subtypen van de trofoblast lijn gelijk aan het in vivo stamcelpopulatie die tot de foetale deel van de placenta. Daarom TSC's bieden een uniek model voor ontwikkeling van de placenta en embryonale versus extra-embryonale Celgedrag in vitro te bestuderen. Vanaf het blastocyst stadium verder, een duidelijke epigenetische barrière die bestaat uit DNA-methylatie en histon modificaties scheidt strak beide geslachten. Hier beschrijven we een protocol om deze lijn barrière volledig overwonnen door transiënte overexpressie van trophoblast belangrijke regulatoren Tfap2c, GATA3, Eomes en ETS2 in muriene embryonale fibroblasten. De geïnduceerde trofoblast stamcellen in staat zijn om zichzelf te vernieuwen en zijn vrijwel identiek aan afgeleide trofoblast stamcellen blastocysten in termen van de morfologie, marker genexpressie en methylatie patroon. Functionele in vitro als in vivo analyses bevestigen dat deze cellen kunnen differentiëren langs de trofoblast lineage genereren polyploïde trofoblast reuzencellen en chimerizing de placenta bij injectie in blastocysten. De inductie van trofoblast stamcellen van somatische weefsels opent nieuwe mogelijkheden voor genetische en epigenetische eigenschappen van deze extra-embryonale afstammingslijn bestuderen en biedt de mogelijkheid om trofoblast stamcellijnen genereren zonder het vernietigen van de respectievelijke embryo.
Introduction
Onlangs heeft een vergelijkende studie van verschillende benaderingen van de muis embryonale stamcellen om stamcellen conversie trofoblast is gebleken dat in alle geanalyseerde systemen, geslacht conversie onvolledig gebleven. In plaats van geïnduceerde trofoblast stamcellen (iTSCs) de zogenaamde trofoblast stamcel-achtige cellen zijn gegenereerd vasthouden van een geheugen van het lot van de cel van oorsprong 1. Hier volgden we een andere benadering van ITSC generatie. Net als bij de directe inductie van pluripotente stamcellen van muizen embryonale fibroblasten (MEF) 2, zijn iTSCs rechtstreeks omgezet van gedifferentieerde somatische weefsel. Ten eerste hebben we geïdentificeerd 12 kandidaat-inducerende factoren TSC lot wanneer overexpressie in MEF. Later zijn de factoren Tfap2c, GATA3, Eomes en ETS2 geïdentificeerd noodzakelijk en voldoende zijn voor de ITSC inductie 3. Tegelijkertijd, een andere groep zelfstandig gevonden Tfap2c, GATA3 en Eomes voldoende om MEF om te zetten in iTSCs te zijn. In datstudie, is de tijd die transgenexpressie aanzienlijk langer in vergelijking met ons onderzoek aangeeft verschillende conversie kinetiek wanneer ETS2 ontbreekt in de transdifferentiatie cocktail 4.
Conventionele foetaal runderserum (FBS) bevattende kweek van geïnduceerde en blastocyst afgeleide trofoblast stamcellen berust op de aanwezigheid van factoren afgescheiden door groei geïnactiveerd MEFs 5,6. Tijdens de ITSC inductie, worden deze elementen door MEF, waarbij de volledige combinatie van transgenen missen en worden transdifferentiatie niet ondergaan. Echter, zodra ITSC individuele kolonies zijn sub-gekweekt, ze vereisen media, die is geconditioneerd door groei geïnactiveerd MEFs. Vanaf dat moment, kan iTSCs gekweekt en behandeld als blastocyst afgeleid TSC's volgens standaard protocollen. Van de nota, in tegenstelling tot Tanaka et al. 5, we regelmatig cultuur TSC's en iTSCs zonder gelatiniseren celkweek gerechten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De 4-factor (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) op basis transdifferentiatie protocol hier gepresenteerde biedt een betrouwbare methode om trouw te genereren omgezet iTSCs van muis embryonale fibroblasten. Verder is de werkwijze ook toepasbaar voor postnatale staart fibroblasten, maar met een afname van efficiëntie vergeleken met embryonale fibroblasten 3. Over het algemeen kwaliteit van primaire fibroblasten is een kritische factor transdifferentiatie uitkomst en voorzichtigheid is geboden vroege passage cellen (p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
