Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas
Summary
Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.
Abstract
células-tronco trofoblasto (CET) surgem como consequência da primeira decisão destino celular no desenvolvimento dos mamíferos. Eles podem ser cultivadas in vitro, conservando a capacidade de auto-renovação e de se diferenciar em todos os subtipos da linhagem trofoblasto, equivalente ao in vivo haste população de células que dá origem à porção fetal da placenta. Portanto, TSCs oferecer um modelo único para estudar o desenvolvimento da placenta e embrionárias contra decisão destino celular extra-embrionário in vitro. Desde a fase de blastocisto em diante, uma barreira epigenética distinto constituído por metilação do DNA e histonas modificações firmemente separa as duas linhagens. Aqui, descrevemos um protocolo para superar totalmente essa barreira linhagem pela transitória sobre-expressão de trofoblastos reguladores chave Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 em fibroblastos embrionárias de ratinho. As células-tronco induzidas trofoblastos são capazes de auto-renovação e são quase idênticas às blastocisto células-tronco trofoblasto derivados in termos de morfologia, expressão do gene marcador e padrão de metilação. Funcional in vitro e em ensaios in vivo confirmam que estas células são capazes de se diferenciar ao longo da linhagem trofoblasto gerar células trofoblásticas gigantes poliplóide e chimerizing a placenta quando injectadas em blastocistos. A indução de células estaminais a partir de tecido somático trofoblasto abre novas vias para estudar as características genéticas e epigenética desta linhagem extra-embrionárias e oferece a possibilidade de gerar linhas de células estaminais trofoblasto sem destruir o respectivo embrião.
Introduction
Recentemente, um estudo comparando várias abordagens de células-tronco embrionárias mouse para Trophoblast conversão de células-tronco revelou que em todos os sistemas analisados, a conversão da linhagem permaneceu incompleto. Em vez de células estaminais induzidas trofoblasto (iTSCs) chamados haste trofoblasto células semelhantes a células foram gerados reter uma memória do destino celular de origem 1. Aqui, seguimos uma abordagem diferente da geração de ITSC. Semelhante à indução directa de células estaminais pluripotentes a partir de fibroblastos embrionários de murídeo (MEFs) 2, iTSCs foram convertidos directamente a partir de tecido somático diferenciada. Em primeiro lugar, foram identificados 12 fatores candidatos indutores TSC destino quando overexpressed em MEFs. Mais tarde, os fatores Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 foram identificados como sendo necessária e suficiente para a indução ITSC 3. Simultaneamente, outro grupo verificou independentemente Tfap2c, GATA3 e Eomes ser suficiente para converter em MEFs iTSCs. No entanto, nesseestudo, o tempo necessário para a expressão do transgene é consideravelmente mais longa em comparação com o nosso estudo, indicando diferentes cinéticas de conversão, quando ETS2 está ausente do cocktail transdiferenciação 4.
Soro fetal convencional de bovino (FBS) contendo a cultura de células estaminais trofoblásticas blastocisto derivado induzidas e baseia-se na presença de factores segregados por MEFs inactivado pelo crescimento 5,6. Durante a indução ITSC, esses fatores são fornecidos por MEFs, que não têm a combinação cheia de transgenes e não são submetidos a transdiferenciação. No entanto, uma vez ITSC colónias individuais são sub-cultivadas, que exigem meios de comunicação, o qual foi pré-condicionada por MEFs inactivado pelo crescimento. A partir daí, iTSCs podem ser cultivadas e tratadas como blastocisto TSCs derivado de acordo com protocolos padrão. É de notar, em contraste com Tanaka et al. 5, que rotineiramente cultura CET e gelatinizar iTSCs sem pratos de cultura de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo de transdiferenciação baseado 4 fator (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) aqui apresentado oferece um método confiável para gerar fielmente convertido iTSCs de fibroblastos de rato embrionárias. Além disso, o método é também aplicável para os fibroblastos da cauda de pós-natal, apesar de com uma queda na eficácia em comparação com os fibroblastos embrionários 3. Em geral, a qualidade de fibroblastos primários é um fator crítico de resultado transdiferenciação e deve ser tomado cuidado…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
