La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible
Summary
Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
Abstract
Maximizar el beneficio de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) para la investigación, la modelización de enfermedades, farmacéuticos y aplicaciones clínicas requiere métodos robustos para la producción a gran escala de tipos de células funcionales, incluyendo los cardiomiocitos. Aquí demostramos que la manipulación temporal de WNT, TGF-β, y SHH vías de señalización conduce a líneas HPSC diferenciación de cardiomiocitos altamente eficiente de una sola célula a pases en tanto la suspensión estática y sistemas de suspensión de biorreactores agitados. El empleo de esta estrategia resultó en ~ 100% superando esferoides, que contiene consistentemente> 80% de células T positivos de troponina cardiaca después de 15 días de cultivo, validados en múltiples líneas HPSC. También informamos sobre una variación de este protocolo para su uso con líneas celulares no está adaptado a los pases de una sola célula, cuyo éxito ha sido verificado en 42 líneas HPSC. Cardiomiocitos generados usando estos protocolos expresan marcadores específicos de linaje y espera mostrar electrophysIOLÓGICA funcionalidades. Nuestro protocolo presenta una plataforma simple, eficiente y robusto para la producción a gran escala de los cardiomiocitos humanos.
Introduction
Las células humanas pluripotentes madre (hPSCs), incluyendo las células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), tienen la capacidad de auto-renovación y la capacidad de diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias 1,2. Debido a estas características, hPSCs proporcionan una fuente valiosa e ilimitado para la generación y escalable de producción de tipos de células relevantes de la enfermedad para el modelado de la enfermedad humana 3-5, para la detección de drogas y de toxicidad ensayos de alto rendimiento 6,7 y potencialmente para aplicaciones clínicas 8 . Generación de los cardiomiocitos de hPSCs ofrece la oportunidad de investigar específicamente los mecanismos de las enfermedades cardiovasculares humanos complejos y sus posibles tratamientos, anteriormente más allá del alcance de nuestra capacidad debido a la falta de modelos animales relevantes y / o la disponibilidad de tejidos primarios afectados.
Todas las aplicaciones mencionadas anteriormente de hPSCs necessitate la producción de un número masivo de los cardiomiocitos altamente enriquecidos y funcionales. Por lo tanto, la disponibilidad de un servicio eficaz, reproducible y escalable in vitro protocolo de diferenciación cardiaca adecuado para múltiples líneas HPSC es crucial. Protocolos de diferenciación de los cardiomiocitos convencionales han empleado diferentes estrategias como la formación de cuerpos embrioides 9, 10 técnicas de co-cultivo, la inducción con un cóctel de citoquinas 11 y métodos de transducción de la proteína 12. A pesar de los avances en estas técnicas, la mayoría todavía sufren de una pobre eficiencia, requieren factores de crecimiento caros, u ofrecer universalidad limitada cuando se trata de utilizar varias líneas HPSC. Hasta la fecha, estos problemas han establecido límites a la producción de los cardiomiocitos derivados de HPSC para los estudios de terapia celular en modelos animales, así como en la industria farmacéutica para el descubrimiento de fármacos 13. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas robustas y asequibles para grandes-scale la producción de cardiomiocitos funcionales derivados de HPSC en sistemas de cultivo escalables facilitaría en gran medida sus aplicaciones comerciales y clínicos.
En este manuscrito, se presenta el desarrollo de un sistema de diferenciación cardiaca rentable e integrada con una alta eficacia, reproducibilidad y aplicabilidad a hESCs y hiPSCs generados a partir de una variedad de fuentes y métodos de cultivo, incluyendo un método para la producción a gran escala de muy poblaciones enriquecidas de cardiomiocitos derivados de HPSC utilizando un biorreactor. Además, hemos optimizado este protocolo para las líneas HPSC no adaptados al alimentador de cultivo celular libre y / o individual, como hiPSCs de nueva creación o grandes cohortes de líneas HPSC pertinentes para el análisis del mecanismo de la enfermedad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los cardiomiocitos derivados de hPSCs son una fuente extremadamente atractivo para su uso en el modelado de la enfermedad humana, la detección de pruebas de drogas / toxicidad y, quizás en el futuro, las terapias regenerativas. Uno de los principales obstáculos para el uso de estas células, sin embargo, es la capacidad para proporcionar suficiente material de alta calidad para su uso efectivo. Utilizando nuestro protocolo descrito, ofrecemos un método que supera esta limitación.
Recien…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Materials
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
References
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