Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible
Summary
Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
Abstract
Maximiser le bénéfice de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) pour la recherche, la modélisation des maladies, des produits pharmaceutiques et des applications cliniques nécessite des méthodes robustes pour la production à grande échelle de types de cellules fonctionnelles, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous démontrons que la manipulation temporelle de WNT, le TGF-β, et les voies de signalisation SHH conduit à des lignes HPSC différenciation des cardiomyocytes très efficace de cellule unique à des passages à la fois la suspension statique et les systèmes de suspension de bioréacteurs agités. Employant cette stratégie a donné lieu à ~ 100% battant sphéroïdes, contenant toujours> 80% de troponine cardiaque des cellules T positives après 15 jours de culture, validés sur plusieurs lignes HPSC. Nous présentons également une variante de ce protocole d'utilisation avec des lignées cellulaires actuellement pas adaptés aux passages à cellule unique, dont le succès a été vérifiée dans 42 lignes HPSC. Cardiomyocytes générés en utilisant ces protocoles expriment des marqueurs spécifiques de la lignée et spectacle attendu electrophysfonctionnalités siologiques. Notre protocole présente une plate-forme simple, robuste et efficace pour la production à grande échelle de cardiomyocytes humains.
Introduction
Les cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et induites des cellules souches pluripotentes (de hiPSCs), ont la capacité d'auto-renouvellement et la capacité de se différencier en cellules des trois couches germinales embryonnaires 1,2. En raison de ces caractéristiques, hPSCs fournissent une source précieuse et illimité pour la production de génération et évolutive de types de cellules pathologiques pertinentes pour la modélisation de la maladie humaine 3-5, pour criblage à haut débit de la drogue et de toxicité des essais 6,7 et potentiellement pour des applications cliniques 8 . Génération de cardiomyocytes de hPSCs offre la possibilité d'étudier spécifiquement les mécanismes de maladies cardio-vasculaires humaines complexes et leurs traitements possibles, déjà au-delà de la portée de nos capacités en raison de l'absence de modèles animaux pertinents et / ou la disponibilité de tissus primaires touchés.
Toutes les applications précitées de hPSCs necessitate la production d'un nombre massif de cardiomyocytes hautement enrichis et fonctionnels. Ainsi, la disponibilité d'une manière efficace, reproductible et évolutive in vitro protocole de différenciation cardiaque approprié pour plusieurs lignes HPSC est crucial. Protocoles de différenciation des cardiomyocytes classiques ont utilisé différentes stratégies telles que la formation de corps embryoïdes 9, les techniques de co-culture 10, l' induction avec des cocktails de cytokines 11 et méthodes de protéine de transduction 12. En dépit des progrès réalisés dans ces techniques, qui souffrent le plus encore d'une mauvaise efficacité, exigent des facteurs de croissance coûteux, ou d'offrir l'universalité limitée lorsque l'on tente d'utiliser plusieurs lignes HPSC. À ce jour, ces défis ont fixé des limites à la production de cardiomyocytes HPSC dérivées pour les études de thérapie cellulaire dans des modèles animaux, ainsi que dans l'industrie pharmaceutique pour la découverte de médicaments 13. Par conséquent, le développement de techniques robustes et abordables pour les grandsproduction -scale de cardiomyocytes fonctionnels HPSC dérivés dans les systèmes de culture évolutive serait largement faciliter leurs applications commerciales et cliniques.
Dans ce manuscrit, nous rapportons le développement d'un système de différenciation cardiaque rentable et intégrée avec une grande efficacité, la reproductibilité et l'applicabilité de CSEh et hiPSCs générés à partir d'une variété de sources et des méthodes de culture, y compris une méthode pour la production à grande échelle de très populations enrichies de cardiomyocytes HPSC dérivées en utilisant un bioréacteur. De plus, nous avons optimisé ce protocole pour les lignes HPSC non adaptées à feeder culture cellulaire libre et / ou simple, comme hiPSCs nouvellement établies ou de grandes cohortes de lignes HPSC pertinentes à l'analyse du mécanisme de la maladie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cardiomyocytes dérivés de hPSCs sont une source extrêmement attrayante pour une utilisation dans la modélisation des maladies humaines, le dépistage dépistage des drogues / toxicité et, peut-être à l'avenir, les thérapies régénératives. L'un des principaux obstacles à l'utilisation de ces cellules cependant, est la capacité de fournir suffisamment de matériaux de haute qualité pour leur utilisation efficace. En utilisant notre protocole décrit, nous proposons une méthode qui surmonte cette…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Materials
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
- Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
- Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577 (2013).
- Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
- Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
- Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
- Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
- Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
- Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
- Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
- Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
- McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
- Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
- Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
- Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
- Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).
