Summary

Het meten van granulocyten en monocyten fagocytose en oxidatieve Burst activiteit in menselijk bloed

Published: September 12, 2016
doi:

Summary

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Abstract

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots (“H” and “F”) of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

Introduction

De granulocyten en monocyten fagocytose / oxidatieve burst (OB) activiteitstest is een eenvoudige, ongecompliceerde techniek die vaak wordt gebruikt om informatie over aangeboren immuunsysteem langdurige en intensieve inspanning verzamelen. 1-4 Bij de studie van de reactie van het immuunsysteem op een stimulus, granulocyten en monocyten zijn van bijzonder belang omdat ze een centrale rol in de afweer spelen en zijn de eerste immuuncellen te accumuleren op de plaats van infectie. 5 neutrofielen, een type granulocyt, zijn de eerste cellen te transloceren in beschadigde spieren weefsel na intensieve inspanning. 6 fagocytose en OB activiteit zijn de meest voorkomende maatregelen en granulocyt monocyt functie 7 en de voorkeur als indicatoren van innate immune celfunctie vanwege hun centrale rol in zowel het infectieproces en het herstelproces.

De test in dit manuscript utili beschrevenZes een basis flowcytometer om een ​​kwantitatieve bepaling van granulocyten en monocyten fagocytose en OB activiteit in volbloed te bieden. Het gebruik van volbloed, deze techniek is voordelig omdat het de bepaling worden uitgevoerd zonder tijdrovende zuiveringsprocedure. Deze test kan eenvoudig worden aangepast om verschillende onderzoeksopzet en lab oplossingen geschikt. Bijvoorbeeld, Liao et al. Gebruik gemaakt van een soortgelijke techniek die neutrofielen OB activiteit vertonen toeneemt en neutrofielen fagocytose verminderd na traumatisch hersenletsel. 8 In een ander voorbeeld, McFarlin et al. Beschreef een elegante modificatie van deze techniek die gebruikt allofycocyanine (APC ) geconjugeerd CD66b en high-performance tandem APC-geconjugeerde CD45 labeling met image-based flowcytometrie naar granulocyten te classificeren in termen van hun fagocytose en OB activiteiten. 7,9

Onze onderzoeksgroep heeft diverse aanpassingen van deze te gebruikenchnique als indicator van het aangeboren immuunsysteem van overgewicht, obesitas en atletische populaties bijna 20 jaar. 10,11 De onderstaande tekst zal de lezer stap-voor-stap instructies voor het uitvoeren van deze test en lichte delen die de lezer aanpassen aan de behoeften van hun onderzoek voldoen.

Protocol

LET OP: Alle incassoprocedures bloed werden uitgevoerd in overeenstemming met de uiteengezet door de Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB) richtlijnen. 1. Assay Voorbereiding Verzamel, voor te bereiden, en het organiseren van de voor de procedure materialen (zie Tabel van specifieke materialen / Equipment). Label 12 x 75 mm buizen. Label twee buizen voor elke deelnemer: één buis voor de fagocytose assay (labelen deze buis met zwart…

Representative Results

Langdurige en intensieve lichaamsbeweging heeft ingrijpende gevolgen voor aangeboren immuunsysteem, met inbegrip van natuurlijke killer celfunctie, macrofaag-cytokine-gemedieerde reactie op virale infectie, en granulocyten en monocyten fagocytose en OB activiteit. Meerdere studies tonen aan dat granulocyten en monocyten fagocytose aanzienlijk toeneemt na het sporten, als gevolg van de ontsteking veroorzaakt door spierbeschadiging en metabole eisen. In contrast, granulocyten en monocyten …

Discussion

Dit manuscript wordt stap voor stap protocol voor de bepaling van twee indicatoren van granulocyt monocyt en functie. We hebben een aantal stappen die cruciaal zijn voor het succes van deze assay worden geïdentificeerd. Een dergelijke stap is het ijsbad incubatie die onmiddellijk voorafgaand aan de toevoeging van bacteriën plaatsvindt. Grondige koeling van alle monsters zal het effect van de temperatuur op fagocytose en OB-activiteit te minimaliseren. Een andere belangrijke stap is de toevoeging van bacteriën aan elk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen graag Zack Shue, Casey John en Lynn Cialdella-Kam erkennen voor hun hulp bij het optimaliseren van deze procedure.

Materials

12 x 75 mm tubes, with cap VWR 20170-579 You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only").
PBS (10X), pH 7.4 Life Technologies 70011-044
Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) Fisher Scientific 09-741-07 
Glucose, powder Life Technologies 15023-021
Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C2404-100G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma-Aldrich S4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) Life Technologies D11347
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous Life Technologies D12345
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) Life Technologies S2851
Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled Life Technologies S-2859
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
4.0 mL vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried VWR BD367861 You will need 1 K2 EDTA blood collection tube per sample.
4.0 mL vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated VWR BD367884 You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample.
COULTER Ac·T 5diff CP Beckman Coulter 6605705 i.e., hematology analyzer
COULTER Ac·T 5diff Rinse Beckman Coulter 8547167
COULTER Ac·T 5diff Fix Beckman Coulter 8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse Beckman Coulter 8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse Beckman Coulter 8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator Beckman Coulter 7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus Beckman Coulter 7547198
AcT 5diff Diluent Beckman Coulter 8547169
200 µL extended-length pipette tips VWR 37001-526
Insulated ice pan VWR 89198-980 For ice water bath.
Open metal tube rack VWR 60916-702
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
TQ-Prep Workstation Beckman Coulter 6605429 i.e., automated cell lyse preparation workstation
ImmunoPrep Reagent System Beckman Coulter 7546999 i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system
Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software Beckman Coulter 626553
IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter 8547008
COULTER CLENZ Beckman Coulter 8546929
Flow-Check Fluorospheres  Beckman Coulter 6605359 i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres
FlowJo Software FlowJo FlowJo i.e., flow cytometry analysis software
Excel Software Microsoft Microsoft Excel i.e., electronic spreadsheet program

References

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).

Play Video

Cite This Article
Meaney, M. P., Nieman, D. C., Henson, D. A., Jiang, Q., Wang, F. Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (115), e54264, doi:10.3791/54264 (2016).

View Video