İnsan Kanı Ölçüm Granülosit ve Monosit Fagositoz ve Oksidatif Burst Etkinlik
Summary
The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.
Abstract
The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots (“H” and “F”) of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.
Introduction
Granülosit ve monosit fagositoz / oksidatif patlama (OB) aktivite deneyi sık sık uzun süreli ve yoğun egzersiz sonrası doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu hakkında bilgi toplamak için kullanılan basit ve düz ileri bir tekniktir. 1-4 bağışıklık sisteminin tepkisini için incelenirken onlar konak savunmasında önemli bir rol oynar ve enfeksiyon yerinde biriken ilk bağışıklık hücreleri, çünkü bir uyarıcı, granülositler ve monositler özel bir öneme sahiptir. 5 Nötrofiller, granülosit bir tür, hasarlı kas içine yerini değiştirmek için ilk hücrelerdir yoğun egzersiz sonrası doku. 6, fagositoz ve Ob faaliyetini granülosit ve monosit fonksiyonu 7 en yaygın önlem ve enfeksiyon nedeniyle işlemi ve onarım işlemi hem de kendi merkezi bir rol doğuştan gelen bağışıklık hücre fonksiyonunun bir göstergesi olarak tercih edilir.
Bu yazıda utili açıklanan tahlilzes bir temel akış sitometresi tam kanda granülosit ve monosit fagositozu ve OB aktivitesinin kantitatif bir belirlenmesine elde edildi. Bu deney, zaman alıcı bir saflaştırma işlemi olmadan yapılan sağlar, çünkü bu teknik tüm kanın kullanılması avantajlıdır. Bu tahlil, kolayca araştırma tasarımları ve laboratuar yetenekleri çeşitli karşılamak için değiştirilebilir. Örneğin, Liao ve ark. Nötrofil Ob faaliyetini göstermek için benzer bir teknik kullanılması, travmatik beyin hasarı aşağıdaki artar ve nötrofil fagositoz azaltılır. 8 Başka bir örnekte, McFarlin et al. Alofikosiyanin kullanan bu tekniğin zarif modifikasyonu (APC tarif ) fagositoz ve OB faaliyetleri açısından granülositler sınıflandırmak için görüntü tabanlı akış sitometri ile CD66b ve yüksek performanslı tandem APC-konjuge CD45 etiketleme konjüge edilmiş. 7,9
Araştırma grubumuz, bu te çeşitli uyarlamaları kullandıYaklaşık 20 yıldır, kilolu obez, ve atletik toplumlarda doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonunun bir göstergesi olarak chnique. 10,11 Aşağıdaki metin, bu testte gerçekleştirmek için adım adım talimatlar ile okuyucuya sunmak ve okuyucu adapte olabilecek alanları vurgulamak olacaktır onların araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, granülosit ve monosit fonksiyonun iki göstergelerin belirlenmesi için adım adım protokolü sağlar. Bu tahlilin başarısı için kritik olan, bir kaç adım belirledik. Böyle bir adım bakterilerin yanı sıra hemen önce meydana buz banyosu inkübasyon olduğunu. Bütün numuneler iyice soğutma fagositoz ve OB aktivitesi üzerinde sıcaklığın etkisini en aza indirir. Bir diğer önemli bir adım her bir örnek için bakteri eklenmesidir. A 8: 1 bakteri: fagosit oranı optimum sonuçlar üretir; A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu prosedürün optimizasyonu sırasında yardım için Zack Shue, Casey John ve Lynn Cialdella-Kam kabul etmek istiyorum.
Materials
| 12 x 75 mm tubes, with cap | VWR | 20170-579 | You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only"). |
| PBS (10X), pH 7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) | Fisher Scientific | 09-741-07 | |
| Glucose, powder | Life Technologies | 15023-021 | |
| Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) | Life Technologies | D11347 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous | Life Technologies | D12345 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) | Life Technologies | S2851 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled | Life Technologies | S-2859 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| 4.0 mL vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried | VWR | BD367861 | You will need 1 K2 EDTA blood collection tube per sample. |
| 4.0 mL vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated | VWR | BD367884 | You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample. |
| COULTER Ac·T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | i.e., hematology analyzer |
| COULTER Ac·T 5diff Rinse | Beckman Coulter | 8547167 | |
| COULTER Ac·T 5diff Fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
| COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
| COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
| COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator | Beckman Coulter | 7547175 | |
| COULTER Ac·T 5diff Control Plus | Beckman Coulter | 7547198 | |
| AcT 5diff Diluent | Beckman Coulter | 8547169 | |
| 200 µL extended-length pipette tips | VWR | 37001-526 | |
| Insulated ice pan | VWR | 89198-980 | For ice water bath. |
| Open metal tube rack | VWR | 60916-702 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| TQ-Prep Workstation | Beckman Coulter | 6605429 | i.e., automated cell lyse preparation workstation |
| ImmunoPrep Reagent System | Beckman Coulter | 7546999 | i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system |
| Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software | Beckman Coulter | 626553 | |
| IsoFlow Sheath Fluid | Beckman Coulter | 8547008 | |
| COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | 6605359 | i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres |
| FlowJo Software | FlowJo | FlowJo | i.e., flow cytometry analysis software |
| Excel Software | Microsoft | Microsoft Excel | i.e., electronic spreadsheet program |
References
- Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
- Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
- Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
- Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
- Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
- Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
- Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
- McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
- Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
- Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
- Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
- Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).
