Misurazione dei granulociti e dei monociti fagocitosi e ossidativo attività Burst nel sangue umano
Summary
The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.
Abstract
The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots (“H” and “F”) of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.
Introduction
Il granulociti e monociti fagocitosi / burst ossidativo (OB) saggio di attività è una tecnica semplice, straight-forward che viene spesso utilizzato per raccogliere informazioni sui innato funzione immunitaria dopo l'attività fisica intensa e prolungata. 1-4 Quando si studia la risposta del sistema immunitario a uno stimolo, granulociti e monociti sono di particolare interesse perché giocano un ruolo centrale nella difesa ospite e sono le prime cellule immunitarie per accumulare nel sito di infezione. 5 neutrofili, un tipo di granulociti, sono le prime cellule di traslocare nel muscolo danneggiato tessuto dopo l'attività fisica intensa. 6 fagocitosi e l'attività OB sono le misure più comuni di granulociti e monociti funzione, 7 e sono preferiti come indicatori di funzione delle cellule immunitarie innate a causa del loro ruolo centrale sia nel processo di infezione e il processo di riparazione.
Il test descritto in questo Utili manoscrittozes un flusso base citometro a fornire una determinazione quantitativa di granulociti e monociti fagocitosi e l'attività OB nel sangue intero. L'uso di sangue intero in questa tecnica è vantaggiosa perché permette il test da condurre senza una procedura di purificazione tempo. Questo test può essere facilmente modificato per accogliere una varietà di disegni di ricerca e capacità di laboratorio. Ad esempio, Liao et al. Utilizzato una tecnica simile a dimostrare che l'attività dei neutrofili OB è aumentata e neutrofili fagocitosi è diminuita in seguito a lesione cerebrale traumatica. 8 In un altro esempio, McFarlin et al. Descrive un elegante modifica di questa tecnica che utilizza allophycocyanin (APC ) coniugata CD66b e ad alte prestazioni in tandem APC-coniugato etichettatura CD45 con image-based citometria a flusso per classificare i granulociti in termini di attività di fagocitosi e OB. 7,9
Il nostro gruppo di ricerca ha utilizzato vari adattamenti di questo TEchnique come un indicatore della funzione immunitaria innata nelle popolazioni in sovrappeso, obesi, e atletiche per quasi 20 anni. 10,11 Il testo qui di seguito vi fornire al lettore con le istruzioni passo-passo per l'esecuzione di questo test ed evidenziare le aree che il lettore può adattare per soddisfare le esigenze della loro ricerca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo manoscritto fornisce un protocollo passo-passo per la determinazione di due indicatori di granulociti e monociti funzione. Abbiamo identificato alcuni punti che sono fondamentali per il successo di questo test. Un tale passo è l'incubazione bagno di ghiaccio che si verifica immediatamente prima dell'aggiunta di batteri. raffreddamento completa di tutti i campioni minimizzerà l'effetto della temperatura sull'attività fagocitosi e OB. Un altro punto critico è l'aggiunta di batteri per ogni c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere Zack Shue, Casey John, e Lynn Cialdella-Kam per la loro assistenza durante l'ottimizzazione di questa procedura.
Materials
| 12 x 75 mm tubes, with cap | VWR | 20170-579 | You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only"). |
| PBS (10X), pH 7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) | Fisher Scientific | 09-741-07 | |
| Glucose, powder | Life Technologies | 15023-021 | |
| Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) | Life Technologies | D11347 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous | Life Technologies | D12345 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) | Life Technologies | S2851 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled | Life Technologies | S-2859 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| 4.0 mL vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried | VWR | BD367861 | You will need 1 K2 EDTA blood collection tube per sample. |
| 4.0 mL vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated | VWR | BD367884 | You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample. |
| COULTER Ac·T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | i.e., hematology analyzer |
| COULTER Ac·T 5diff Rinse | Beckman Coulter | 8547167 | |
| COULTER Ac·T 5diff Fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
| COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
| COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
| COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator | Beckman Coulter | 7547175 | |
| COULTER Ac·T 5diff Control Plus | Beckman Coulter | 7547198 | |
| AcT 5diff Diluent | Beckman Coulter | 8547169 | |
| 200 µL extended-length pipette tips | VWR | 37001-526 | |
| Insulated ice pan | VWR | 89198-980 | For ice water bath. |
| Open metal tube rack | VWR | 60916-702 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| TQ-Prep Workstation | Beckman Coulter | 6605429 | i.e., automated cell lyse preparation workstation |
| ImmunoPrep Reagent System | Beckman Coulter | 7546999 | i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system |
| Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software | Beckman Coulter | 626553 | |
| IsoFlow Sheath Fluid | Beckman Coulter | 8547008 | |
| COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | 6605359 | i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres |
| FlowJo Software | FlowJo | FlowJo | i.e., flow cytometry analysis software |
| Excel Software | Microsoft | Microsoft Excel | i.e., electronic spreadsheet program |
References
- Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
- Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
- Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
- Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
- Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
- Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
- Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
- McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
- Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
- Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
- Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
- Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).
