This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.
염색체 외 원형 DNA를 (eccDNAs)는 사카로 마이 세스 세레 비지에 공통의 유전 적 요소뿐만 아니라 다른 진핵 생물에서보고됩니다. EccDNAs는 다세포 생물의 체세포들과 단세포 진핵 생물의 진화에 유전 적 변이에 기여한다. eccDNA을 검출하기위한 민감한 방법은 이러한 요소 게놈 안정성과 방법 환경 및 생물학적 요인 진핵 세포에서의 형성을 유도에 미치는 영향을 명확히 할 필요가있다. 이 동영상은 원 – 서열라는 민감한 eccDNA 정제 방법을 제시한다. 상기 방법은 원형의 DNA, 선형 염색체 DNA, eccDNA 롤링 써클 증폭 깊은 시퀀싱 매핑 잔여 제거 칼럼 정제를 포함한다. 광범위한 엑소 뉴 클레아 제 처리를 충분히 선형 염색체 DNA의 분해에 요구되었다. 하여 롤링 써클 증폭 공정오프라인 – 높이 :. 정상; "10 10 세포의 세 S. cerevisiae의 CEN.PK 인구의 원-SEQ 방법> 선형 DNA를 통해 원형 DNA에 대한 풍부한 φ (29) 중합 효소 유효성 검사는 1 킬로보다 큰 크기의 eccDNA 프로파일 수백 검출 . ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, S288c 및 CEN.PK는 DNA의 회람이 유전자좌에서 균주 사이에 보존되는 것을 알 수 모두에서 원형 DNA에 HXT7 유전자. 합에서의 반복 된 결과, 서클-SEQ 방법은 광범위한있다 진핵 생물뿐만 아니라 특정 eccDNA 유형을 검출 eccDNA위한 게놈 규모 스크리닝 적용.
이 세포의 큰 인구에 단일 DNA 분자의 변화를 확인이 필요하기 때문에 초기 또는 과도 염색체 증폭을 검출하는 것은 어렵다. 염색체 복사 번호 변형 (CNVs)은 일반적으로 변화 1, 2를 생성 메커니즘의 증거로 만 최종 CNV 구조를 떠나, 그들의 설립 후 잘 검출된다. 검출 및 유전자 재 배열에서 진행중인 프로세스를 규명 할 수 맥락막 신생 혈관 형성의 초기 단계에서 염색체 외 원형 DNA (eccDNA)를 복구.
이전의 eccDNA 새로이 발견 전자 현미경 3 중기 염색체 4, 2 차원 전기 영동 5 김사 염색 하였다. 이러한 방법은 원형 DNA의 서열에 대해 거의 또는 전혀 정보를 제공합니다. 이러한 남부는 현장 hybridizatio에서 PCR 8, 반대 6, 7, 또는 형광을 블로 팅으로 대상 기술N 9 특정 eccDNA 요소에 대한 증거를 제공합니다. 이러한 방법 중 어느 것도 셀 인구에있는 기존의 모든 eccDNA 유형의 순서를 제공하지 않습니다.
세포의 풀에서 발산 게놈은 게놈 서열 및 / 또는 타일 어레이 (10, 11)을 특징으로 할 수있다. 종래 DNA 정제 방법에 의해 결실 또는 증폭을 검출하는 것은 일반적으로 돌연변이 된 대립 유전자는 세포 집단 (12, 13)의 적어도 0.1 %를 나타내는 것을 필요로한다. Acentric eccDNAs 인해 자신의 중심절의 부족과 복제에서 DNA 합성의 가능성이없는 경우에 세포 배양에 더욱 과도 것으로 예상된다. 대부분은 아마도 eccDNAs 소량에 있고 그 서열이 게놈 유사 보낸 따라서, 다른 DNA 추출 방법 eccDNAs를 검출 할 필요가있다.
몇몇 원형 DNA 정제 기술은 염색체 DNA 원형의 구조적 차이를 이용한다. 예 고속 용 ultracentrifug염화 세슘 구배에 ATION 인간 헬라 암 세포주 14 350-3000 염기쌍 (BP) 큰 eccDNAs을 분리하는데 사용된다. 그러나, 고속의 침강 속도 (15) 및 eccDNA 수율 변경 닉 수퍼 코일을 원형 DNA 구조의 골격을 끊거나 할 수있다. 두타와 동료는 드 노보, 마우스 조직에서뿐만 아니라 닭의 문화와 인간의 세포 (16, 17)에서 원형 DNA의 게놈 규모 식별하는 방법을 개발했다. 그들의 방법은 플라스미드 정제 및 효소 반응 및 DNA의 추출 몇 차례 뒤에 자당 초 원심 분리에 의한 균질 조직에서 핵의 추출이다. 이들 프로토콜은 주로 200 ~ 400 염기쌍의 eccDNAs라는 microDNAs를 식별합니다. 두타와 동료는 사카로 마이 세스 세레 비지에서 microDNAs의 정화를 시도했지만이 효모 종 16 microDNA를 기록 할 수 없습니다.
우리는 새로운 방법을 개발했다원 – 서열라는 효모에서 eccDNA의 드 노보 검출. 이 방법은 전체 유전자를 수행하기에 충분히 큰 및 86 킬로 (킬로바이트) 미토콘드리아 DNA (미토콘드리아 DNA)로 큰 원형의 DNA 분자에 대한 게놈 규모의 설문 조사를 할 수 있습니다. 서클-SEQ 방법은 진핵 효모 세포에 최적화 깊은 서열과 결합 잘 설립 원핵 플라스미드 정제 방법 (18, 19)에서 개발되었다. 서클-서열 접근, 1756 다른 eccDNAs, 모든보다 큰 1킬로바이트를 사용하여 10 S.에서 검출되었다 cerevisiae의 S288c 20를 집단. 크기 컷 – 오프는 전체 유전자를 수행하기에 충분히 큰했다 eccDNA에 초점을 선택되었다. 원 – 서열은 매우 민감; 그것은 전지 (20)의 수천에서 하나의 eccDNA를 발견했습니다. 현재 연구에서, 원형 서열이 분리 다른 S. 세 생물학적 복제에서 294 eccDNAs를 식별하는 데 사용 cerevisiae의 효모 균주, CEN.PK. 데이터 eccDNA 공통 유전자 eleme이라고 밝혀S.에서 NT cerevisiae의 변종.
서클-SEQ 방법은 시퀀스 레벨 해상도 효모 세포 eccDNA 게놈 크기의 검출을 허용한다. 상기 방법은 집중 소용돌이 또는 피펫을 필요로하고, 다음 단계에서 엑소 뉴 클레아 제 소화에 이어질 것이다 eccDNA 파괴를 제한하는 중력 컬럼 분리를 사용하지 않는 온화한 eccDNA 정제이다. 방법의 이러한 기능은 유전자 서열을 포함하는 큰 eccDNAs을 검출하기위한 중요 할 수있다. 원 – 서열 전체 유전자 (데이터 집합 1) 등 다양한 eccDNAs를 발견했습니다. 또한 86 킬로바이트 효모 미토콘드리아 DNA를 발견했습니다. 따라서,이 프로토콜은 대형 원형 DNA 요소의 정화를 용이하게한다. 최소 DNA 추출 단계의 수를 유지하는 eccDNA 손실 위험을 감소시키고 수율을 최대화한다. 제어 결과에 기초하여, 아군 된 플라스미드, 원형 서열이 2500 세포로부터 단일 원형 DNA를 검출하는 매우 민감하다. 또한, 이러한 2μ 같은 풍부한 내인성 플라스미드를 제거; 플라스미드 또는 미토콘드리아 DNA는 크게 감도를 향상시킬 수 있습니다. 효모 문화 2μ의 경화 (30)을 설명 하였다. 또한, 2μ 및 미토콘드리아 DNA의 제거는 SwaI 같은 희귀 절단 효소, 달성 될 수 있습니다. 그러나, 제한 효소 공정은 다른 관심 eccDNAs 타겟팅 및 eccDNA 총 생산량을 제한 할 수있다.
eccDNA 검출을위한 중요한 단계는 적절한 깊이로 선형 DNA (3 단계) 및 DNA 시퀀싱 (5 단계)을 제거했다. 셀 인구에서 eccDNAs의 대부분을 기록하려면, 깊은 시퀀싱 (20)를해야 할 수도 있습니다. 원형 DNA 접합이 페어 엔드를 얻을 것으로 예상 discordantly 그지도를 읽고대로 쌍 엔드 시퀀싱, eccDNA 검출의 더 큰 신뢰를 제공해야합니다. 이러한 불일치는 원형 DNA 구조의 검색을 지원 잠재적 추가 eccDNA 검출 필터로서 사용된다.
서클 – 괜찮다Q 방법은 3 개의 독립적 인 S.를 이용하여 검증 하였다 cerevisiae의 CEN.PK 인구. 감지 서열은 이전에 eccDNAs, 내생 플라스미드를보고 아군 된 플라스미드 및 추정 eccDNAs (데이터 집합 1) 수백 포함되어 있습니다. 이러한 연구 결과는 S.에서 이전 원 – 서열 데이터 세트를 지원 cerevisiae의 S288c 20. CEN.PK 및 S288c 집단에 공통적 인 몇 가지 eccDNAs의 발견은 이러한 궤적이 같은 원형 요소 (그림 4)이 존재하는 성향이 있음을 나타냅니다. 우리는 이전에 다른 변형 배경에 [GAP1 원]의 증거가 발견되지 않았습니다 불구하고 [GAP1 원이]를 CEN.PK 배경 8 질소 제한된 조건에서 농축되는 것으로 나타났습니다. S288c 및 CEN.PK 모두에서 CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 및 HXT6 HXT7 궤적에서 eccDNA의 발견은 DNA의 회람에 대한 경향은 사기꾼입니다 제안효모 균주 사이에 봉사했다. [HXT6 / 7 원], [ASP3-1 원], [COS111 원] 및 [CUP1-1 RSC30 원]을 세포 또는 경우에 선택적 이점을 부여하는 경우 그것은 그들의 존재는 단지 높은 비율의 효과가 나타 남아 DNA의 회람.
종합하면, 결과는 원형 서열이 킬로 크기 eccDNAs 검출에 적합하고 완전한 유전자 eccDNAs를 식별하는 장점을 가지고 있음을 나타낸다. 원 – 서열은 효모에서 eccDNAs의 전체 게놈 규모의 스크린을 가능하게하는 매우 중요한 방법이다. 서클-SEQ 방법은, 유전자 증폭 및 삭제를 생성 eccDNA의 역할을 해명을 목표로 연구의 새로운 필드를 열 수있다. DNA 구조와 구조가 크게 높은 진핵 생물에 진핵 효모에서 보존되는 점을 감안, 서클-SEQ 방법은 원칙적으로 상 해당해야한다약간의 수정과 함께, 모든 진핵 세포에 전자. 현재 방법은 megabase 크기 eccDNAs를 정화하는 능력이 아직 표시하도록했지만, 어떤 제한이 나타나지 않는다. 또한, 롤링 써클 증폭 방법 (31)을 사용 ø29 DNA 중합 효소의 사용, eccDNA 정량보다 어렵게 작은 eccDNAs쪽으로의 바이어스를 생성한다. 원형 서열 인간 체세포에서 두 분 원형 DNA에 대한 연구에 적합하다, 전체 유전자를 운반하기에 충분히 큰 eccDNAs를 검출한다. 프로토 암 유전자가 이러한 요소 32-37에서 증폭 할 때 두 분은 암에 기여할 수있다. 생식선 세포 eccDNAs의 연구는 생식 계열 돌연변이 비율을 측정하고, 가축, 예를 들어, 정자의 품질을 평가하는데 사용될 수있다. 따라서, 원형 서열이 유전자 저작권법과 관련된 질환의 새로운 이해 유전 적 변이는 카피 수 변화의 형태로 발생하는 속도에 대한 통찰력을 수득하고 유도 할 가능성이있다수 변동 38-40.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Kenn D. Møller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. Jørgensen for quantitative PCR analysis.
Bacto peptone | BD Difco | 211677 | Alternative product can be used. |
Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix | Agilent Technologies | 600882 | For qPCR analysis. Alternative product can be used. |
Dextrose (D-glucose) | Carl Roth | HN06.4 | Alternative product can be used. |
Disruptor Beads, 0.5 mm | Scientific Industries, Inc. | SI-BG05 | Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used. |
Ethidium bromide | Carl Roth | 2218.2 | Agarose gel stain for detecting DNA/RNA. |
GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo Fisher | K0502 | Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used |
NotI, FastDigest | Life Technologies - Thermo Fisher Scientific, USA | FD0594 | Endonuclease. Alternative product can be used. |
Plasmid Mini AX kit | A&A Biotechnology, Poland | 010-50 | Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA. |
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit | Epicentre, USA | E3105K | ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used. |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich, USA | 81845 | Alternative product can be used. |
pUG6 plasmid | EUROSCARF, Germany | P30114 | Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch |
QIAGEN genomic-tip 100/G | Qiagen, USA | 13343 | Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used. |
REPLI-g Mini Kit protocol | Qiagen, USA | 150023 | Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase |
Yeast extract | BD Difco | 210929 | Alternative product can be used. |
Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) | Nordic BioSite, Sweden | Z1004-3 | Alternative product can be used. |
Data access to sequence files | European Nucleotide Archive | EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. | |
Strains | |||
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | Genotype MATa MAL2-8c SUC2 | ||
Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool | EUROSCARF, Germany | S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0 genexxx::KanMX. | |
Equipments | |||
DNA Spectrophotometer | NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher | Measuring DNA concentration. Alternative product can be used. | |
Fluorescence microscopy | Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. | Alternative product can be used. | |
Robotic library-build system | Apollo 324, IntegenX Inc. | DNA library preparation. Alternative product can be used. | |
Sequencing platform | Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. | DNA sequencing. Alternative product can be used. | |
Ultrasonicator | Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes | Alternative product can be used. | |
Methods | |||
2% YPD media | Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave. | ||
Circle-Seq test on genomic DNA | Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. | ||
Mapping software | Bowtie2 aligner, John Hopkins University | Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359. | |
Propidium iodide stain | Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). | ||
Workflow bioinformatic system | Galaxy, Open source. | A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. "Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists". Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. "Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis." Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5. |