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Biology

Purification de l'ensemble du génome de l'ADN extrachromosomique circulaire à partir de cellules eucaryotes

Published: April 04, 2016
doi:
10.3791/54239
, , , , ,
1Department of Biology,University of Copenhagen, 2National Veterinary Institute,Technical University of Denmark, 3Group Health Research Institute, 4Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics,Princeton University, 5Calico Life Sciences LLC

Summary

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

Abstract

ADNs circulaires extrachromosomiques (eccDNAs) sont des éléments génétiques communs dans Saccharomyces cerevisiae et sont rapportés dans d' autres eucaryotes ainsi. EccDNAs contribuent à la variation génétique entre les cellules somatiques dans des organismes multicellulaires et à l'évolution des eucaryotes unicellulaires. Des méthodes sensibles pour détecter eccDNA sont nécessaires pour clarifier la façon dont ces éléments affectent la stabilité du génome et comment les facteurs environnementaux et biologiques induisent leur formation dans des cellules eucaryotes. Cette vidéo présente une méthode eccDNA-purification sensible appelé Circle-Seq. La méthode comprend la colonne de purification d'ADN circulaire, l'élimination de rester ADN linéaire chromosomique, cercle roulant amplification de eccDNA, le séquençage profond, et la cartographie. un traitement par une exonucléase étendue linéaire a été nécessaire pour la dégradation de l'ADN chromosomique suffisante. L'étape de laminage-amplification en cercle parine-height:. normal; "> φ 29 polymerase enrichi pour l' ADN circulaire sur l' ADN linéaire Validation de la méthode Circle-Seq sur trois populations S. cerevisiae CEN.PK de 10 10 cellules détecté des centaines de profils eccDNA dans des tailles plus grandes que 1 kilobase . constatations répétées de ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 gènes sur l' ADN circulaire dans les deux S288c et CEN.PK suggère que l' ADN circularisation est conservée entre les souches de ces loci. en somme, la méthode Circle-Seq dispose d'un large applicabilité pour le dépistage échelle du génome pour eccDNA chez les eucaryotes, ainsi que pour détecter les types de eccDNA spécifiques.

Introduction

La détection précoce ou transitoire amplification chromosomique est difficile car elle nécessite l'identification des altérations dans les molécules d'ADN simple dans de grandes populations de cellules. Chromosomiques nombre de copies variations (CNV) sont généralement bien détectés après leur mise en place, ne laissant que la structure finale CNV comme preuve du mécanisme qui a généré la variation 1,2. La détection et la récupération de l'ADN extrachromosomique circulaire (eccDNA) dans les premiers stades de la formation CNV pourrait élucider les processus en cours dans les réarrangements génomiques.

Auparavant, de novo a été découverte eccDNA par des micrographies électroniques 3, Giemsa des chromosomes métaphasiques 4, ou une électrophorèse sur gel bidimensionnelle 5. Ces méthodes fournissent peu ou pas d'informations sur la séquence de l'ADN circulaire. Techniques ciblées telles que Southern blot 6,7, PCR inverse 8, ou de la fluorescence hybridizatio in situn 9 fournissent des preuves que sur les éléments spécifiques de eccDNA. Aucun de ces procédés fournissent la séquence de tous les types de eccDNA existant dans une population cellulaire.

Divergence génomique dans un pool de cellules peut être caractérisée par le séquençage du génome et / ou des tableaux de carrelage 10,11. La détection d' une deletion ou une amplification par des procédés de purification d'ADN classiques nécessite habituellement qu'un allèle muté représentent au moins 0,1 à 1% de la population cellulaire 12,13. EccDNAs acentrique sont censés être encore plus transitoire dans une culture de cellules en raison de leur manque de centromères et en l'absence de potentiel de la synthèse de l'ADN en réplication. Ainsi, puisque la plupart eccDNAs sont vraisemblablement en faibles quantités et leurs séquences ressemblent le génome, les méthodes d'extraction d'ADN alternatives sont nécessaires pour détecter eccDNAs.

Plusieurs techniques circulaires de purification d'ADN exploitent les différences structurelles entre les chromosomes et de l'ADN circulaire. Par exemple, ultracentrifug haut débitation dans des gradients de chlorure de césium est utilisé pour isoler 350-3000 paires de bases (pb) grandes eccDNAs du cancer HeLa lignée cellulaire humaine 14. Cependant, à grande vitesse peut se briser ou nick l'épine dorsale de structures d'ADN circulaires surenroulés, la modification de la vitesse de sédimentation 15 et le rendement eccDNA. Dutta et ses collègues ont développé une méthode de novo, l' identification échelle du génome d'ADN circulaire à partir de tissus de souris ainsi que des cultures de poulet et les cellules humaines 16,17. Leur méthode consiste à extraire des noyaux de tissus homogénéisés par ultracentrifugation de saccharose suivie d'une purification du plasmide et plusieurs séries de réactions enzymatiques et les extractions d'ADN. Leur protocole identifie principalement eccDNAs 200-400 pb, appelées microDNAs. Dutta et ses collègues ont également tenté purification de microDNAs de Saccharomyces cerevisiae , mais ont été incapables d'enregistrer microDNA de cette levure espèces 16.

Nous avons développé une nouvelle méthode pourde novo détection de eccDNA de levure appelée Circle-Seq. Cette méthode permet des enquêtes échelle du génome pour des molécules d'ADN circulaires assez grandes pour porter des gènes entiers et aussi grands que les 86 kilobases (kb) de l'ADN mitochondrial (ADNmt). La méthode Circle-Seq a été développé à partir d' un plasmide procaryote procédé de purification bien établie 18,19, optimisé pour les cellules de levure eucaryotes et combiné avec le séquençage profond. En utilisant l'approche de Circle-Seq, 1756 eccDNAs différents, tous plus de 1 kb, ont été détectés à partir de dix S. cerevisiae S288c Populations 20. Un seuil de coupure a été choisi de se concentrer sur eccDNA qui étaient assez grand pour transporter des gènes entiers. Circle-Seq est très sensible; il a détecté un seul eccDNA au sein de milliers de cellules 20. Dans l'étude actuelle, Circle-Seq a été utilisé pour isoler et identifier 294 eccDNAs de trois répétitions biologiques d' une autre S. cerevisiae souche de levure, CEN.PK. Les données révèlent que eccDNA est une eleme génétique communent S. souches cerevisiae.

Protocol

NOTE: Un aperçu de la purification de l' ADN circulaire et méthode de séquençage (Circle-Seq) est illustrée à la figure 1. 1. La culture, Cell récolte et Plasma Membrane Perturbation Inoculer des cellules de levure (par exemple Saccharomyces cerevisiae) à partir d' une culture O / N dans 50 ml de milieu nutritif complet de la levure peptone dextrose (YPD). Inoculer à une densité cellulaire initiale faible de 1-3 x 10 5 cellules / ml ou une densité optique d'environ 0,01 DO600. Incuber les cellules à 30 ° C sous agitation à 150 tours par minutes (rpm) jusqu'à ce que les cellules atteignent une densité cellulaire maximale d'environ 1 x 10 10 cellules, après environ 24-48 h , soit une densité optique à 600 DO> 10,0. REMARQUE: Le temps de culture est pas crucial que les concentrations cellulaires plus faibles peuvent être utilisés. Transférer la culture trop grands dans un tube conique de 50 ml, d'une pastille les cellules par centrifugation à800 g pendant 3 min et jeter le surnageant. Laver le culot avec 25 ml de solution tampon de Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, re-sédimenter les cellules par centrifugation à 800 g pendant 3 minutes et éliminer le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de remise en suspension de 1,2 fourni par un kit de purification de plasmide colonne. Etape facultative: Ajouter des plasmides très dilués comme témoins pour la purification des éléments d'ADN circulaires 20. NOTE: Dans l'ensemble de données en cours, un mélange plasmidique de 7,7 ul a été appliqué pour chaque échantillon contenant 10 10 cellules. Le mélange plasmidique stock se composait de trois plasmides dans différentes concentrations; pBR322 à 38 ng / échantillon, pUC19 à 0,5 ng / échantillon et pUG72 à 0,01 ng / échantillon. Transférer la suspension cellulaire dans deux tubes de 2 ml de micro-centrifugeuse, chaque supplémenté avec des perles de verre de 0,5 mm à un rapport de 1: 3 du volume de la suspension totale. Vortex chaque tube à vitesse maximale pendant 10 min pour perturber des cellules plasmatiquesmembranes. Pellet les billes par centrifugation à 268 g pendant 30 sec et transférer 1,2 ml surnageant combiné des deux tubes à centrifuger dans un nouveau tube. NOTE: Alternative à l'étape 1,6-1,7, utilisez zymolyase pour perturber les cellules dans une solution tampon de 0,6 ml de resuspension. Dix unités de zymolyase peuvent perturber 5 x 10 7 cellules à moins de 1,5 heure à 35 ° C. 2. EccDNA Enrichissement par Chromatographie sur colonne Suivre le protocole à partir d'un kit pour la colonne de purification de plasmides. En bref, traiter chaque échantillon avec 1,2 ml de solution alcaline, mélanger délicatement et incuber 3 min à température ambiante. Ajouter 1,2 ml de tampon de neutralisation, mélanger délicatement et centrifuger à 9650 xg pendant 5 min. Charger la solution sur une colonne équilibrée avec une solution de 1 ml d'équilibrage et de permettre au liquide de circuler à travers la colonne par gravité. Laver la colonne avec une solution de lavage 4 ml. Lorsque la solution est passée à travers la résine, on ajoute avec précaution 0,3 ml d'éluant de façonrésolu- pour remplacer la plupart des 0,35 ml volume de colonne vide. Éluer l'ADN dans un nouveau tube de prélèvement avec une solution de 1 ml d'élution et précipiter l'ADN par addition de 0,8 ml d'un mélange de précipitation. Centrifuger à 9650 xg pendant 10 min. Laver le culot d'ADN avec 0,5 ml d'éthanol à 70%, centrifuger à 9650 g pendant 5 min, de l'air sec pendant 5 à 15 minutes, et de dissoudre l'ADN purifié dans 25 ul d'eau stérile. REMARQUE: Seul le stockage à court terme de l'ADN dans l'eau est recommandé. Préférentiellement, passez directement à l'étape 3. 3. La digestion de l'ADN chromosomique restant linéaire Etape facultative: Pour faciliter la digestion spécifique de l'ADN linéaire par exonucléase, traiter l'ADN purifié avec une endonucléase rare coupe tels que Notl. Pour 5 pg d'ADN, en utilisant une unité Notl, 5 pi de 10 x tampon de digestion et de l'eau stérile jusqu'à un volume total de 50 ul. Incuber la réaction à 37 ° C pendant 16 heures et la chaleur inactiver l'endonucléase à 80 ° C pendant 5 min. Ajouter 20les unités d'exonucléase (2 pl), 4 ul d'ATP (25 mM), 34 pi d'eau stérile et 10 ul de 10 x tampon de réaction directement à l'ADN endonucléase clive 50 ul pour atteindre un volume réactionnel de 1 x 100 ul, en utilisant l'exonucléase dépendante de l'ATP trousse. Effectuer l'hydrolyse de l'ADN simple brin et double brin linéaire à 37 ° C pendant 5 jours ou plus. Ajouter un supplément de 4 pi ATP (25 mM), 0,6 ul 10x tampon de réaction et 20 unités exonucléase toutes les 24 heures pour continuer la digestion de l'ADN enzymatique à un volume de réaction 1x. Après élimination de l' ADN linéaire, l' échantillon 2 ul de la solution traitée exonucléase pour confirmer l' élimination de l' ADN chromosomique linéaire par quantitative réaction en chaîne par polymérase (PCR quantitative), en utilisant un marqueur chromosomique tel que le gène de l' actine ACT1 20. QPCR chaque volume de réaction de 20 pi contenant 2 pi exonucléase échantillon traité, à 150 nm ACT1 amorces 5 'TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3' et 5'-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3 ', 2% (volume / volume) de diméthylsulfoxyde, et 10 pi vert mélange maître fluorescent. Utiliser la condition de réaction; 3 min à 95 ° C, puis 45 cycles de 15 s à 95 ° C et 30 s à 60 ° C. NOTE: ACT1 est un marqueur particulièrement approprié pour l' ADN linéaire depuis nombre de copies des variations de ce gène sont délétères 21-23 alors eccDNA ne devrait pas porter ACT1. Alternatives à l'analyse de l'ADN digestion par qPCR sont PCR standard (4.3) ou l'iodure de propidium (4.4). 2 pi de l' échantillon en utilisant une exonucléase traité comme matrice de PCR avec des amorces 5'-ACT1 TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 'et 5'-GAACGACGTGAGTAACACC-3'. Comme le contrôle de ACT1 positif, utilisez 50-100 ng génomique S. ADN cerevisiae comme matrice. les conditions de réaction PCR; 3 min à 95 ° C, puis 35 cycles de 30 s à 95 ° C, 30 s à 56 ° C et 1 min à 72 ° C. réactions Run PCR par gel électrophoresis sur agarose à 1% avec 0,5 pg / ml de bromure d'éthidium. Rechercher un 0,8 kb ACT1 bande. L'absence ou la présence d'ADN linéaire peuvent également être examinés par l'iodure de propidium, avant et après amplification de l'ADN. Mélanger chaque échantillon d'ADN dans un 1: le volume 1 avec un 1: H 2 O solution diluée de 20 mM d' iodure de propidium Stock 1000. Laisser la solution dans l'obscurité pendant 10 à 20 min à température ambiante et à analyser la coloration de l'ADN par microscopie à fluorescence à un grossissement de 100x en utilisant un filtre d'excitation de fluorescence rouge à 663-738 nm et un temps d'exposition de 5 à 30 secondes. Comme le contrôle ADN-coloration, l'utilisation ø29 amplifié l'ADN génomique de la levure et / ou plasmide ø29-amplifié. Inactivent la chaleur de la solution d'exonucléase à 70 ° C pendant 30 min. 4. Amplification d'ADN Amplifier purifié et enrichi eccDNA de l' étape 3.5) avec ø29 ADN polymérase 24-26 accordment au protocole du fabricant de la polymérase. En bref, mélanger 5 pi enrichi eccDNA avec un tampon de dénaturation de 5 pi. Au bout de 3 min à température ambiante, ajouter le tampon de neutralisation de 10 ul. Mélanger délicatement et ajouter mélange maître 30 ul contenant 29 pi de tampon de réaction et 1 pl de l'ADN polymérase. Laisser incuber la réaction à 30 ° C pendant 16 heures ou plus (jusqu'à 72 h). La chaleur inactivent l'ADN polymérase de Ø29 à 65 ° C pendant 3 min. 5. Le séquençage et l'analyse des données Cisaillement l'eccDNA amplifié avec un appareil à ultrasons focalisé à une taille cible maximale moyenne de 300 pb. Utilisez les paramètres suivants pour un échantillon de 130 pi d'ADN: puissance 450W d'intensité maximale, 60 traitement sec, 30% facteur de service, 200 cycles par rafale, la température de 7 ° C. Ajouter des étiquettes et des cartes d'index codes à barres à lit la fragmentation pour la synthèse de bibliothèques de séquençage, en utilisant une méthode appropriée pour la préparation bibliothèque. Exécutez le séquençage profond, par exemple, comme 141-nucléotide simple-end se lit sur une plate-forme de séquençage à haut débit. Carte lit au génome de référence de levure sous enquête et de permettre la lecture à la carte à plusieurs régions. Par exemple, utiliser un système de workflow disponible gratuitement 27,28 et de courte lecture logiciel de cartographie aligneur 29. Identifier lit des régions de eccDNAs putatifs en utilisant contiguës se lit, par exemple, plus de sept contigus lit (> 1 kb) sans lacunes 20. REMARQUE: Le logiciel est disponible 27,28 pour explorer mappé lit à des régions génomiques d'intérêt.

Representative Results

Pour valider la méthode Circle-Seq, trois S. populations cerevisiae CEN.PK de 1 x 10 10 cellules ont été criblés après que les cellules ont été cultivées séparément dans YPD pendant dix générations. L' ADN chromosomique linéaire élimination a été confirmée par l'absence d'un signal RET1 qPCR comme décrit précédemment 20 (données non représentées). Purifié et enrichi eccDNA a été séquencée jusqu'à 68 millions de lectures (141-nucléotide unique fin lit) et mis en correspondance avec le génome de référence CEN.PK113-7D (de la version 19 Juin 2012). Des enregistrements de eccDNAs putatives provenant des trois échantillons désignés C1, C2 et C4 ont été assignés à des régions génomiques contiguës cartographiés par lit plus de 1 kb. Sur la base de 10.000 simulations de Monte Carlo, la signification de chaque région cartographiée par contiguë lit plus de 1 kb a été estimé. De ce 79, 159 et 56 régions ont été annotés comme des séquences eccDNA probables (p <0,1, Dataset 1). Le nombre de contiguo enregistrénous lit> 1 kb a augmenté en fonction de la profondeur de séquence suggérant que même plusieurs éléments de eccDNA auraient été enregistrés si des échantillons avaient été séquencés plus (Figure 2). Comme prévu, la méthode des cercles Seq extrait de nombreuses lectures à partir d'un certain nombre d'éléments connus circulaires d'ADN incluant le plasmide 2μ, l'ADN mitochondrial, les gènes d'ARN ribosomique sur le chromosome XII, et les trois plasmides de contrôle interne pBR322, pUC19 et pUG72 qui ont été injectés dans des échantillons juste avant la purification sur colonne (figure 3). La vidéo montre un exemple de tracé qui indique contigu au locus HXT7 _ARS432_ HXT6 sur le chromosome IV. Auparavant, le [HXT6 / 7 cercle] a été détecté par Circle-Seq en dix populations S288C (chacun avec 1 x 10 10 cellules) et la structure de l' ADN circulaire a été confirmée par une analyse par PCR inverse 20. Le [HXT6 / 7 circle] a également été enregistrée dans chacune des trois populations CEN.PK (figure 4A). En outre, la plupart des gènes communs eccDNA entre échantillons répétés de CEN.PK chevauchaient gènes eccDNA des ensembles de données S288C (figure 4B). Pour tester la spécificité du protocole de cercle Seq pour la purification d'ADN circulaire, deux échantillons, chacun avec un ADN génomique de 30 pg ont été testés. Un échantillon a été additionné de 100 ng d'ADN de plasmide et eccDNA à partir des deux échantillons ont été purifiés par le protocole de cercle Seq. Après séparation de la colonne, le rendement de l'ADN était de 1,27% (380 ng) de l'échantillon sans plasmide (GD) et 1,60% (480 ng) de l'échantillon avec le plasmide (GD + P). L'efficacité du traitement exonucléase a été testé pour le contenu linéaire de l' ADN après 29 h et 72 h par PCR contre ACT1. Aucun échantillon contenait amplifié ACT1 (données non présentées). Une fraction de chaque échantillon traité par exonucléase est en outre unmplified par le Ø29 polymérase et les produits des réactions enzymatiques ont été analysées par coloration à l'iodure de propidium (figure 5A-F) et une électrophorèse sur gel d' agarose (figure 5G). Les échantillons après le traitement exonucléase montré propidium minimal d' iode-taches (figure 5A-B). Le ø29 – amplifié échantillon avec l' ADN génomique ne se révèle que des structures filiformes (Figure 5C) similaires à l'échantillon témoin (Figure 5E). Le ø29 – amplifié échantillon qui avait révélé le plasmide ajouté foyers (Figure 5D) ressemblant à la commande de plasmide (Figure 5F). Les images ont indiqué que Ø29 polymérase enrichie en ADN circulaire sur l'ADN linéaire. La plupart de l' ADN chromosomique linéaire a été retiré à partir d' échantillons après le traitement 29 h exonucléase (figure 5A-B, G). Cependant, une vaste traitement exonucléase pendant plus de 100 heures et en utilisant plus de 100 unités a été nécessaire pour éliminer tout ADN linéaire chromosomique, comme O29 – échantillons amplifiés ont montré encore un fond de structures filiformes après 72 heures de traitement exonucléase (Figure 5C-D). . Figure 1. Schéma de la méthode de cercle Seq Le protocole comporte 5 étapes: 1) mettre en culture cellulaire, 2) la purification et l' enrichissement de eccDNA par Chromatographie sur colonne, 3) la digestion du reste de l' ADN chromosomique linéaire dans la fraction d' éluat, 4) l' amplification de ADN par l' ADN polymerase Ø29, et 5) le séquençage des hautement enrichi eccDNA et la cartographie de lit au S. génome de référence cerevisiae. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg "/> Figure 2. Contigu lit> 1 kb en fonction de la profondeur de la séquence. EccDNA de 1 x 10 10 cellules augmentent en fonction de la profondeur de la séquence (en millions de mappé lit). Montré: triplicats biologiques de haploïde CEN.PK S. populations cerevisiae (C1, C2, C4) séparés par 10 10 divisions cellulaires. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. Détection d'éléments d'ADN circulaire connus. (AB) Scatter parcelles de couverture de lecture (lecture densité) en pour cent pour les plasmides dans CEN.PK biologique réplicats C1, C2 et C4. (A) mappé lit aux plasmides endogènes de la levure sont: 2μ; [ADNr cercle] (gènes d'ARN ribosomal provenant du chromosome XII); et ADNmt (l'ADN mitochondrial). (B) Unique lectures mappé pour contrôler les plasmides. plasmides de contrôle ont été injectés dans des échantillons avant la purification de la colonne. ratios Plasmides par cellule étaient: pBR322 (signes plus) 1: 1, pUC19 (cercles) 01:50, et pUG72 (triangles) 1: 2500. Figure 4. éléments eccDNA commun dans CEN.PK et S288c. (A) diagramme de Venn affichant un chevauchement entre les 476 294 gènes sur des éléments eccDNA dans les trois échantillons CEN.PK (C1, C2, C4). Les 16 gènes qui se chevauchent eccDNA / plasmides communs sont annotées (tous les noms de gènes sont en Dataset 1). (B) un diagramme de Venn de tous les gènes enregistrées sur eccDNAs putatives provenant des trois échantillons CEN.PK (C1, C2, C4), par rapport à tous les gènes enregistrées sur eccDNAs putatives provenant de 10 échantillons S288C: S1-S2, R1-R4, Z1-Z4 (voir référence 20). Montré sont 13 répétitions biologiques (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, C1-C3) avec des gènes / plasmides et régions putatives eccDNA qui chevauchaient un minimum de 2 milieux de contrainte et 3 ou plus expérimentales configurations. les échantillons C, CEN.PK; des échantillons de R et Z, S288c BY4741; Échantillons S, S288c M3750. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5. Visualisation des échantillons d'ADN après exonucléase et ø 2 9 traitement. (AF) L'iodure de propidium coloration de l' ADN. Barre d'échelle, 10 pm. Les échantillons contenant de l' ADN génomique (A, C et E) (GD); GD échantillons avec plus de plasmide (GD + P) (B et D). ( <str ong> AB) Après le traitement exonucléase 29 h (EXO 29 h); (CD) après le traitement exonucléase 72 h suivie par ø29 polymérase amplification (EXO 72 h + O29). (E) Contrôle génomique de l' ADN après e: ø29 polymérase amplification; (F) de commande de plasmide (5,5 kb) après 29 l'amplification par la polymérase; (G ø) agarose gel électrophorèse. De gauche à droite: L, 1 marqueurs kb; P, le contrôle de plasmide (5,5 kb) après EXO 29 h; GD, après EXO 29 h (échantillon en A); GD + P, après EXO 29 h (échantillon B); GD et GD + P, après EXO 29 h + ø29; GD et GD + P, après EXO 72 h + ø29 (échantillon en CD). Voir le tableau S1 Pour plus de détails supplémentaires. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. ASET 1 "src =" / files / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg "/> 1. régions d' ADN de circularisation de Dataset potentiels dans CEN.PK. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier. Montré sont données de séquence et d'analyses pour 348 régions. Les colonnes sont AD, cartographie eccDNA. A (première colonne de gauche), l'échantillon à partir duquel putative eccDNA a été identifié; B, chromosome; CD, début et fin de coordonnées eccDNAs putatifs. EH, contenu eccDNA. E, séquence à replication autonome (ARS) dans la région; F, le gène complet de la région; G, une partie du gène inclus dans la région; H, le gène BLASTN-identifié. IO, la couverture EccDNA et les valeurs p. I, la plus longue région avec une séquence annotée unique en pb; J, le nombre de lectures tout tracé; K, la couverture de tous les mappé lit par fragments par kb à partir d'un million de mappé lit (FPKM); L, p-valeur pour putative eccDNA par rapport à l'apparition par hasard de simulations de Monte Carlo; M, le nombre de noniquely mappé lit; NON; comme K et L en utilisant uniquement mappé unique lit (UFPKM). Paramètres pour la cartographie des lectures et des simulations de Monte Carlo ont été comme décrit 20.

Discussion

La méthode Circle-Seq permet la détection du génome échelle de eccDNA à partir de cellules de levure avec une résolution de niveau de séquence. La méthode est une purification de eccDNA doux qui ne nécessite pas de vortex ou pipetage intensif et utilise la séparation par gravité de la colonne pour limiter la casse eccDNA qui conduirait à une digestion exonucléasique dans l'étape suivante. Ces caractéristiques du procédé peuvent être cruciales pour détecter les grands eccDNAs qui contiennent des séquences de gènes. Circle-Seq détecté de nombreux eccDNAs y compris les gènes complets (Dataset 1). Il a également détecté la levure ADN mitochondrial de 86 kb. Ainsi, ce protocole facilite la purification de grandes des éléments d'ADN circulaires. En réduisant le nombre d'étapes d'extraction d'ADN à un minimum réduit le risque de perte eccDNA et optimise le rendement. Sur la base des résultats de contrôle, enrichis en plasmides, Circle-Seq est très sensible, la détection d'un ADN circulaire unique à partir de 2500 cellules. En outre, l'élimination des plasmides endogènes abondants tels que 2μ; plasmide ou ADN mitochondrial pourraient améliorer considérablement la sensibilité. Le durcissement de 2μ à partir de cultures de levure a été décrite 30. Alternativement, 2μ et l'élimination de l'ADN mitochondrial pourraient être obtenus avec une endonucléase rare coupe, comme Swa. Cependant, l'étape d'enzyme de restriction pourrait cibler d'autres eccDNAs d'intérêt et de limiter le rendement de eccDNA totale.

Les étapes critiques pour la détection eccDNA étaient l'élimination de l'ADN linéaire (étape 3) et le séquençage de l'ADN (étape 5) à une profondeur adéquate. Pour enregistrer la majorité des eccDNAs à partir d' une population de cellules, le séquençage en profondeur peut être nécessaire 20. séquençage Jumelé-end devrait fournir encore plus la confiance de la détection eccDNA, car on prévoit des jonctions d'ADN circulaires pour donner apparié-end lit cette carte discordantly. Ces écarts supportent la découverte de structures d'ADN circulaires et peuvent éventuellement être utilisés en tant que filtre de détection eccDNA supplémentaire.

Le Cercle-Seméthode q a été validée à l' aide de trois S. indépendante populations cerevisiae CEN.PK. Séquences détectées incluses précédemment rapporté eccDNAs, des plasmides endogènes et dopés dans des plasmides et des centaines de eccDNAs putatifs (DataSet 1). Ces résultats soutiennent les ensembles de données Cercle-Seq précédents de S. cerevisiae S288c 20. La découverte de plusieurs eccDNAs communes aux populations CEN.PK et S288C indique que ces loci ont une propension à exister comme des éléments circulaires (figure 4). Nous avons précédemment montré que le [GAP1 cercle] est enrichi sous azote conditions limitées dans le CEN.PK fond 8, bien que la preuve de [GAP1 cercle] dans d' autres milieux de contrainte n'a pas été trouvé. Conclusion de eccDNA du CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 et HXT6 HXT7 loci dans les deux S288c et CEN.PK suggère qu'une prédisposition pour l' ADN circularisation est conservi entre les souches de levure. Il reste à démontrer si [HXT6 / 7 cercle], [cercle ASP3-1], [COS111 cercle] et [cercle CUP1-1 RSC30] confèrent des avantages sélectifs aux cellules ou si leur existence est simplement un effet de taux élevés de ADN circularisation.

Pris ensemble, les résultats indiquent que Circle-Seq est bien adapté pour détecter eccDNAs de kilobases taille et présente des avantages pour identifier eccDNAs avec des gènes complets. Circle-Seq est une méthode très sensible qui permet des écrans entiers génome échelle de eccDNAs de la levure. La méthode Circle-Seq pourrait ouvrir un nouveau champ de recherche visant à élucider le rôle de eccDNA dans la génération de délétion de gènes et amplifications. Étant donné que l'architecture de l'ADN et la structure sont en grande partie conservées de la levure eucaryote à des eucaryotes supérieurs, la méthode Circle-Seq devrait, en principe, être applicable à toutes les cellules eucaryotes, avec de légères modifications. À l'heure actuelle, la méthode ne semble pas avoir de limites, bien que sa capacité à purifier eccDNAs de mégabases taille n'a pas encore été démontré. En outre, l'utilisation de Ø29 ADN polymérase, qui utilise un procédé d'amplification de cercle roulant 31, crée un biais vers les petites eccDNAs rendant plus difficile la quantification eccDNA. Circle-Seq détecte eccDNAs assez grands pour porter des gènes complets, ce qui convient pour les études sur l'ADN double-minutes circulaires à partir de cellules somatiques humaines. Double minutes peuvent contribuer au cancer lorsque les proto-oncogènes sont amplifiés sur ces éléments 32-37. Les études de eccDNAs dans les cellules germinales pourraient être utilisés pour mesurer les taux de mutation germinale et d'évaluer la qualité du sperme, par exemple dans l'élevage. Ainsi, Circle-Seq a le potentiel pour donner un aperçu de la vitesse à laquelle la variation génétique se pose sous la forme de la variation du nombre de copies, et conduire à une nouvelle compréhension des maladies qui impliquent des gènes d'auteurvariation du nombre de 38-40.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Thanks to Kenn D. Møller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. Jørgensen for quantitative PCR analysis.

Materials

Bacto peptone BD Difco 211677 Alternative product can be used.
Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix  Agilent Technologies 600882 For qPCR analysis. Alternative product can be used.
Dextrose (D-glucose) Carl Roth HN06.4 Alternative product can be used.
Disruptor Beads, 0.5 mm Scientific Industries, Inc. SI-BG05 Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used.
Ethidium bromide Carl Roth 2218.2 Agarose gel stain for detecting DNA/RNA.
GeneJet plasmid miniprep kit Thermo Fisher K0502 Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used 
NotI, FastDigest Life Technologies -  Thermo Fisher Scientific, USA FD0594 Endonuclease. Alternative product can be used. 
Plasmid Mini AX kit  A&A Biotechnology, Poland 010-50 Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA.  
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit Epicentre, USA E3105K ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used.
Propidium iodide  Sigma-Aldrich, USA 81845 Alternative product can be used.
pUG6 plasmid EUROSCARF, Germany P30114 Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch
QIAGEN genomic-tip 100/G  Qiagen, USA 13343 Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used.
REPLI-g Mini Kit protocol  Qiagen, USA 150023 Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase 
Yeast extract BD Difco 210929 Alternative product can be used.
Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) Nordic BioSite, Sweden Z1004-3 Alternative product can be used.
Data access to sequence files European Nucleotide Archive  EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. 
Strains
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D Genotype MATa MAL2-8c SUC2
Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool EUROSCARF, Germany S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0 genexxx::KanMX.
Equipments
DNA Spectrophotometer  NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher Measuring DNA concentration. Alternative product can be used.
Fluorescence microscopy Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. Alternative product can be used.
Robotic library-build system Apollo 324, IntegenX Inc. DNA library preparation. Alternative product can be used.
Sequencing platform Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. DNA sequencing. Alternative product can be used.
Ultrasonicator Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes Alternative product can be used.
Methods
2% YPD media  Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave.
Circle-Seq test on genomic DNA Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. 
Mapping software Bowtie2 aligner, John Hopkins University Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359.
Propidium iodide stain Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). 
Workflow bioinformatic system Galaxy, Open source. A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. "Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists". Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. "Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis." Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5.
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Møller, H. D., Bojsen, R. K., Tachibana, C., Parsons, L., Botstein, D., Regenberg, B. Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (110), e54239, doi:10.3791/54239 (2016).
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