İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için
Summary
Birincil insan plasental (villöz) ve plasental organ kültürleri oluşturmak için basit bir yöntem tarif edilmektedir. Villus ve desidual organ kültürleri, insan maternal-fetal arayüzünde patogenezinde eğitim için çok değerli araçlardır. Fakültatif hücre içi bakteri Listeria monocytogenes ile enfeksiyon gösterilmiştir.
Abstract
Plasenta Türler arası anatomik değişkenlik geniş ölçüde göstermektedir. en iyi biyoloji ve insan plasenta patofizyolojisi anlamak için insan hücreleri ve dokuları kullanarak deney tasarlama zorunludur. Organ kültürü bir avantajı, üç boyutlu (3D) bakım yapısal organizasyon ve hücre-dışı matris. Burada anlatılan yöntemin amacı, ex vivo insan gebelik doku organ kültürleri başarılı kurulması ve 72-96 saat süreyle onların sağlıklı kültür bakımıdır. protokol işletim paketi taze araştırma-rıza gösterilen, plasenta ve desidual örneklerin hemen işleme ayrıntıları. Bunlar aksi takdirde iptal olacak bol örneklerdir. 3D Organ kültürleri kurmak için uygun dokuların nasıl seçileceği ile ilgili morfolojik ayrıntıları içeren bu örneklerin, steril koleksiyonu ile ilgili ayrıntılı talimatlar sağlanır. Plasental villus ve desidual dokular 2-3 mm 3 adet haline microdissected edilirve birkaç gün boyunca matris kaplı Transwell filtreleri üzerinde ayrı ayrı yerleştirilir ve kültürlü. Villöz ve desidual organ kültürleri, insan-konak etkileşim çalışma için uygundur. diğer organizma modellerine göre de, bu insan kültürleri konut spesifitesine değişen örnekleri göstermektedir patojenler için enfeksiyon oluşturma mekanizmaları incelemek için özellikle avantajlıdır. Bir örnek olarak, biz klinik olarak anlamlı, fakültatif hücre içi bakteri patojen Listeria monocytogenes ile plasental ve desidual organ kültürleri enfeksiyonunu gösterir.
Introduction
maternal-fetal arayüzünde enfeksiyon ve inflamasyon kadın ve çocukların morbidite ve mortalitenin önemli bir kaynağını temsil eder. patojenler bu dokuları bulaştırmak nasıl anlamak önlemek ve bu tür erken doğum ve fetal ölüm gibi hastalıkları tedavi etmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Ancak, maternal-fetal arayüzü yüksek türler arası değişkenlik deneysel soruşturma zorlaştırmaktadır. Ayrıca, en mikrobiyal patojenler konak özgüllüğü, böylece birçok hayvan modelleri tamamen insan bulaşıcı hastalıklar özetlemek olamaz göstermektedir. Örneğin, Listeria monocytogenes gibi diğer ev sahibi özgüllük 1 daha orta seviyede gösterirken belirli organizmalar (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio kolera, ve çok sayıda diğerleri), insanlarda tamamen patojeniktir. Spasifitelerinin kolonizasyon 2, yayılması 3, bağışıklık kaçırma 4 de dahil olmak üzere, patogenezi birçok açıdan belgelenmiştir </syukarı> ve besin elde etme 5. Bu nedenle, uygun bir ev sahibi model sistemler seçmek için büyük önem taşımaktadır.
Fetal hücre ve anne kanı oluşan plasenta hızla gebeliğin 6 boyunca gelişen bir organdır. En basit anlamda, insan plasenta anne kanında boğulmuş fetal "villous" ağaç benzeri yapıların inşa edilmiştir. Gaz ve besin alışverişi villöz ağaçların yüzeyini döşeyen trofoblast adı verilen özel fetal hücre katmanları arasında oluşur. anne rahim mukozası astar, gebe olmayan kadınlarda endometrium olarak adlandırılan fetoplasental birimi karşılamak için desidua içine yapısal ve fonksiyonel dönüştürür. Villöz ağaçlar desidua içine hücre sütunları demirleme göç extravillous trofoblastlar (EVT) tarafından rahim içine demir atmış. maternal-fetal arayüzü, bu nedenle, desidua ve plasenta oluşur.
Organ kültürü tekniği Burada anlatılanL. dahil nerede ve nasıl klinik olarak önemli insan patojenleri incelemek için kullanılır olmuştur monocytogene s ve Toxoplasma gondii, plasenta bariyerini 2,7 çapraz. Bu ex vivo organ kültürleri in vivo doku mimarisi çoğaltmak ve insan plasenta için tartışmasız fizyolojik son derece alakalı model sistemler vardır. Ek kültür teknikleri 3D-matris içine gömülü Tüm organ eksplantlar, organ dilimleri ve doku veya kök hücre organoids içerir. Bu seçeneklerle ilgili ayrıntılar için, kapsamlı bir son gözden 8 bakınız. Bu protokol desidua ve plasenta villus ayrı kültürü için olduğunu lütfen unutmayın. plasental hücreleri ve desidual hücreler arasındaki etkileşimi incelemek için, bir ko-kültür tekniği tercih edilebilir. Biz trofoblast aracılı desidual vasküler remodeling 9-11 okuyan araştırmacılar tarafından kullanılan, daha önce açıklanan villöz-desidual ko-kültür tekniği, ilgi okuyucu bakın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kendilenmiş, transgenik ve nakavt fare suşları sağlam mekanizmalar test etmek deneysel sistemlerde hizmet edebilir. Bununla beraber, temel genetik materyal genel korumaya karşın, farelerde ve insanlarda işlevsel genomları düzenleyici elemanlar 23 önemli farklılıklar ortaya koymaktadır. Bu nedenle, hayvan modellerinde bu umut vaat eden klinik öncesi çalışmalar, bazen insan hastalarda şaşırtıcı değildir değinmeyecek değildir edilir. Plasenta, böylece insan hastalığı 24 çalışması için hayvan modelleri daha az ideali sonra render çok yüksek türler arası çeşitlilik gösterir. İnsan ve fare immünoloji 25 önemli farklılıklar ve plasental anatomi telaffuz farklı evrim hem kabul eden deneysel araştırma için insan gebelik dokularının ex vivo organ kültürleri kullanımını dikkate isabetli olmuştur.
Bu protokolde açıklamaları, fotoğraf görüntüleri ve öğretim video ile ilgili araştırmacılar talimatECM-kaplı Transwell doku kültürü ekler üzerine villöz ve desidual organı kültürleri nasıl kurulabileceğini. Bu tekniğin avantajları özellikle de 3D gömülü matrisler veya organ dilim kültürleri gibi alternatif yöntemlere kıyasla mikro-diseksiyon göreceli basitlik ve mekanik destek Transwell sistemini içerir. Membran desteği organ kültürü Süspansiyon tüm doku yüzeylerinde besin alışverişi için izin verir ve canlılık kısa süreli kültür (villus kültürler için 96 saat, desidual kültürlerin 72 saat) .Bu teknik dokusunda insan plasental biyoloji eğitimi için izin verir muhafaza edilir seviye, tek tabakalı hücre kültürü modellere göre tartışmasız daha biyolojik ilgili.
Bu protokolde en kritik adım organ kültürü için uygun villus ve desidua parçaları mikro diseksiyonudur. Doku optimal parçaları fotografik göstermiştir (Şekil 2A ve Şekil 3A) için araştırmacılar yardım etmek içingebelik örneklerin görselleştirme yenidir. Hücreler ECM göç ve zara villuslar çapa yardımcı olacak gibi, dalları EVT sütunlarında sona villöz ağaçları seçmek için özellikle önemlidir. organ kültürleri her iki tip için dikkatli ve telaşsız bir şekilde pipetleme medya değişiklikleri sırasında dokuya bozuklukları en aza indirmek için yardımcı olur.
Bu teknik sadece asgari zorluklar vardır. vesilesiyle, numuneler kontaminasyonu göstermektedir. Bulaşma genellikle bakteriyel (bazen poli-mikrobiyal) ve sadece kültürde 1-2 gün sonra belli olur. kontamine sonra, ağartma kültürü atıldı uygulanmalıdır, ve doku kültürü kuluçka uzun süreli bir sorunu önlemek için sterilize edilir. numune hasat / işleme sırasında utero enfeksiyonu, ameliyat sırasında, ya da organ kültürü bakımı sırasında: birkaç olası kontaminasyon ortaya çıkabilecek yolu vardır. Hasat ve işlem adımları büyük olasılıkla zaman vardırve kirlenme yer tanıtılması. Nedenle, örnek toplama ve mikro-disseksiyon de kolaydır süreyi azaltmak için çok önemlidir. Bu ortam, steril olmayan ortama örnek maruziyeti azaltacaktır. laboratuar kurulumuna bağlı olarak, diseksiyon mikroskobu steril doku kültürü kaputu içinde yer alabilir.
Tıbben ilgili patojen L. ile enfeksiyon sonrası organ kültürleri histopatolojik analizi monocytogenes, protokol olası bir uygulama olarak burada gösterilmiştir. patojenlere insan konak yanıtı içine enfeksiyon verimleri yeni anlayışlar sonra hem bakteri ve konak bağışıklık hücrelerinin İmmünofloresan lokalizasyonu. Desidual organ kültürleri fare desidual makrofaj savunma fonksiyonları 26,27 kusurları gösteren ilginç raporlar da dahil olmak üzere in vivo fare enfeksiyonları, elde edilen verileri incelemek için tamamlayıcı ex vivo deney tekniği olarak hizmet olabilir. Buna ek olarak, insan OrgBir kültürler, L. birkaç izogenik suşu oluşan bir rekabet aşı malzemesi olarak, karışık enfeksiyon stratejilerinde kullanılabilir monocytogenes. organ kültürleri Rekabet enfeksiyon insan konak içinde virülans faktörlerinin önemini test etmek için hassas bir yoldur. Bu yöntemin bir kısıt kısa süreli kültür (villus kültürler için 96 saat, desidual kültürlerin 72 saat) ile sınırlıdır doku canlılığı vardır. Bu, L. gibi hızlı büyüyen mikroplarla enfeksiyon için ideal monocytogenes, ancak daha uzun kültürleri kurmak ve doku içinden yaymak için daha fazla zaman alır patojenler için gerekli olabilir.
gebelik komplikasyonlarının küresel yükünü azaltmak için, araştırma, insan maternal-fetal arayüzü patofizyolojisinin anlaşılmasında odaklanması gerekmektedir. Bakteriyel, fungal ve gebelik ve fetal enfeksiyon komplikasyonları yıkıcı neden anneden fetüse çapraz viral patojenler. Laboratuvar ani in vivo enfeksiyon kontrollümals tipik patojenler kolonize ve organlar 28 arasında geçiş nasıl adresleme için altın standart olarak kabul edilir. plasental anatomi memeli türler arasında belirgin farklılık, çünkü araştırma stratejileri içine insan dokusu dahil etmek büyük önem taşımaktadır. İnsan villus ve desidual organ kültürleri konak-patojen araştırmak için son derece alakalı model sistemler vardır. Bu hayati henüz tam olarak anlaşılamamıştır organı incelemek için, araştırmacılar, burada açıklandığı gibi organ kültürü stratejileri kullanarak, aksi takdirde iptal insan plasental ve desidua örneklerin bolluğu yararlanabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Cristina Faralla and David Lowe for helpful discussions. We acknowledge Mark Weinstein and San Francisco General Hospital Pathology Department for expert advice. This work was supported by National Institute of Health grants R01AI084928 and Burroughs Wellcome Fund 41259 to A.I.B; G.A.R. was supported by F32AI108195, Society for Pediatric Pathology Young Investigator Research grant, and University of California Partnerships for Faculty Diversity President’s Post-doctoral Fellowship.
Materials
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4in, 1×2 0.5mm, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4in, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 mL conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10X Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10X PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1000X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 mL Ethanol and adding 34.3 mL PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 mL ethanol and adding 40 mL PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert – 30mm diameter, 0.4μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~300μL aliquotsin the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23 (2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. . Pathology of the Human Placenta. , (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods in enzymology. 236, 405-420 (1994).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. . The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I. Pathogens and the placental fortress. Current opinion in microbiology. 15, 36-43 (2012).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66 (2006).
