שלית Decidual אדם תרבויות איברים ללמוד זיהומים בבית הממשק האם והעובר
Summary
שיטה פשוטה להקים השליה אדם מן המעלה הראשונה (villous) ותרבויות איבר decidual מתואר. תרבויות איבר Villous ו decidual הם כלי שלא יסולא בפז ללימוד בפתוגנזה בממשק האם והעובר האדם. זיהום עם חיידקים ליסטריה חיידק תאי פקולטטיבי מודגם.
Abstract
השליה מראה מידה רבה של השתנות אנטומיים interspecies. כדי להבין בצורה הטובה ביותר בביולוגיה והפתופיזיולוגיה של השליה האנושית, זה הכרחי כדי לעצב ניסויים באמצעות תאים ורקמות אנושיים. יתרון של תרבות איברים הוא תחזוקה של תלת ממדי (3D) מבנה ארגוני ואת מטריקס. מטרת השיטה המתוארת כאן היא הקמה מוצלחת של תרבויות איברי רקמות vivo לשעבר אדם הריונית ותחזוקת התרבות הבריאה שלהם עבור 72-96 שעות. הפרוטוקול מפרט את העיבוד המיידי של מחקר-הסכמתי, שלית דגימות decidual הטרי מסוויטת ההפעלה. אלה הם דוגמאות בשפע כי הייתה להיות מושלכת אחרת. הוראות מפורטות על אוסף סטרילי של דגימות אלה, כוללים פרטים מורפולוגיים על איך לבחור רקמות מתאימות להקים תרבויות איבר 3D, מסופקות. רקמות villous ו decidual השליה הם microdissected לתוך 2-3 מ"מ 3 חתיכותוהניח בנפרד על מסנני transwell מרופדת מטריקס ותרבותי במשך כמה ימים. Villous ותרבויות איבר decidual מתאימים גם לחקר האינטראקציה מארח הפתוגן האנושי. לעומת אורגניזמים מודל אחרים, תרבויות האנושיות אלה הן יתרון במיוחד לבחון מנגנון של זיהום עבור פתוגנים הממחישים דפוסים משתנים ספציפי מארח. כדוגמא, אנחנו מדגימים זיהום של תרבויות איבר שלית decidual עם משמעות הקלינית, החיידקים ליסטריה פתוגן חיידקי תאיים פקולטטיבי.
Introduction
זיהום ודלקת בממשק האם והעובר מהווים מקור מרכזי לתחלואה ותמותה בנשים וילדים. ההבנה כיצד פתוגנים להדביק רקמות אלה היא קריטית להתפתחות של אסטרטגיות רומן למנוע ולטפל במחלות כגון צירים מוקדמים ומוות עובר. עם זאת, השתנות interspecies גבוהה של הממשק האם והעובר מסבכות חקירה ניסויית. יתר על כן, פתוגנים חיידקים ביותר להראות הספציפיות המארח, ובכך במודלים של בעלי חיים רבים אינם יכולים לשחזר מחלות זיהומיות אנושי לגמרי. אורגניזמים מסוימים (אינפלואנזה המופילוס, typhi סלמונלה, כולרה Vibrio, ועוד רבים אחרים) הם פתוגניים אך ורק בני אדם, בעוד שאחרים, כגון חיידקים ליסטריה, להראות רמה בינונית יותר של מארח סגולי 1. סגולי מארח תועד בהיבטים רבים של בפתוגנזה, כולל קולוניזציה 2, הפצה 3, התחמקות חיסונית 4 </sעד>, ורכישת 5 מזין. לכן, זה הוא בעל חשיבות עליונה לבחירת מערכות מודל מארח אופטימליות.
לחן של תאים העובר בדם האם, השליה היא איבר שמתפתח במהירות במהלך ההריון 6. במונחים פשוטים, השליה האנושית בנויה עובריים "villous" מבני עץ דמוי הטבולים בדם אימהי. גז וחילופי מזין מתרחשים על פני שכבות של תא עובריים מיוחדות הנקראות trophoblasts המרפד את השטח של עצי villous. רירית ברירית הרחם האימהי, כינה רירית הרחם אצל הנקבה שאינן בהריון, הופך מבנית והן מבחינה תפקודית לתוך decidua כדי להתאים את יחידת fetoplacental. עצים Villous מעוגנים לתוך הרחם על ידי trophoblasts extravillous (EVT) הנודדים עיגון עמודות התא לתוך decidua. ממשק האם והעובר, ולכן, מורכב decidua ואת השליה.
טכניקת תרבות האיבר מתוארת כאןנעשה שימוש כדי לבחון היכן וכיצד פתוגנים אנושיים משמעות קלינית, כולל L. monocytogene s ו Toxoplasma gondii, לחצות את מחסום השליה 2,7. תרבויות איבר vivo לשעבר אלה לשכפל באדריכלות רקמות vivo, הן ללא ספק פיסיולוגי מאוד מערכות מודל רלוונטיות עבור placentation אדם. טכניקות תרבות נוספות כוללות explants איבר שלם, פרוסות איברים, רקמות או תא גזע organoids מוטבע-מטריקס 3D. לקבלת פרטים אודות אפשרויות אלה, עיין בדיקה שנערכה לאחרונה מקיפה 8. יש לציין כי פרוטוקול זה הוא עבור התרבות הנפרדת של decidua ו villi שליה. ללימוד האינטראקציה בין תאי שליה ותאי decidual, טכניקת תרבות שיתוף עשויה להיות מועדפת. אנו מפנים את הקורא המעוניין לטכניקת שיתוף התרבות villous-decidual שתוארה לעיל, בשימוש על ידי חוקרים לומדים שיפוץ כלי דם decidual בתיווך trophoblast 9-11.
Protocol
Representative Results
Discussion
זנים טהורים, מהונדס ועכבר נוקאאוט יכולים לשרת מערכות ניסיוניות לבחון מנגנונים וחסונים. עם זאת, למרות שימור כללי של חומר גנטי ליבה, הגנום התפקודי של עכברים ובני אדם להפגין הבדלים משמעותיים גורמים רגולטוריים 23. אין זה מפתיע, אם כן, כי במחקרים פרה מבטיחים במודלים של בעלי חיים הם לפעמים לא לחזור בדיוק בחולים אנושיים. ההשליה מראה גבוה מאוד מגוון interspecies, ובכך טיוח במודלים של בעלי חיים פחות אידיאלי לחקר מחלות אנושיות 24. הכרה הוא ההבדלים הניכרים לעין באימונולוגיה אדם ועכבר 25, ואת האבולוציה מתבדר המבוטאת באנטומיה שליה, זה נבון לשקול את השימוש של תרבויות vivo לשעבר איבר של רקמות הריונית אדם לחקירה ניסיונית.
התיאורים, צילומי תמונות, סרט הדרכה בפרוטוקול זה להורות חוקרים עלאיך להקים villous ותרבויות איבר decidual על מוסיף תרבות ECM מצופה רקמה transwell. היתרונות של טכניקה זו כוללים את הפשטות היחסית של מיקרו-לנתיחה ומערכת transwell תמיכה מכאנית, במיוחד בהשוואה לשיטות חלופיות כגון מטריצות-מוטבע 3D או תרבויות פרוסה איברים. השעיה של תרבות האיבר על תמיכה הממברנה מאפשרת לחילופי מזין בכלל משטחי הרקמות כדאיים נשמרה לתרבות לטווח קצר (96 שעות עבור תרבויות villous, 72 שעות עבור תרבויות decidual) טכניקת .זה מאפשרת לחקר ביולוגית שליה אנושית על הרקמות רמה, ללא ספק יותר ביולוגי רלוונטי מאשר דגמי תרבית תאי monolayer.
השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא לנתיחה מיקרו של חתיכות villous ו decidual המתאים לתרבות איברים. חתיכות אופטימליות של רקמות מודגמות photographically (איור 2 א ו איור 3 א) כדי לעזור לחוקרים שעבורםהדמיה של דגימות הריונית היא חדשה. זה חשוב במיוחד כדי לבחור עצים villous שענפיו לסיים בעמודות EVT, כמו תאים אלה יעברו לתוך ECM ולעזור לעגן את villi הממברנה. עבור שני סוגי תרבויות איבר עוזר למזער הפרעות לרקמה במהלך שינויי תקשורת על ידי pipetting באופן זהיר חפוז.
טכניקה זו מקשה מינימאלית בלבד. בהזדמנות, דגימות להראות זיהום. זיהום הוא בדרך כלל חיידקים (מדי פעם פולי-מיקרוביאלי), ורק מתברר לאחר 1-2 ימים בתרבות. לאחר הזיהום הוא ציין, אקונומיקה צריכה להיות מיושמת, התרבות מושלכת, ואת החממה בתרבית הרקמה מעוקרת כדי למנוע בעיה לטווח ארוכה. ישנן מספר דרכים אפשריות זיהום שעלול להתעורר: זיהום ברחם, במהלך ניתוח, במהלך מסיק / עיבוד דגימה, או במהלך תחזוקת התרבות איברים. שלבי הקציר ועיבוד הם הזמן הסביר ביותרומקום זיהום להיות מוצג. לכן, חשוב להפחית את כמות זמן הדגימה היא מניפולציה במהלך איסוף דיסקציה מיקרו. זה יקטין חשיפת דגימת הסביבה, בסביבה לא סטרילית. בהתאם להגדרת מעבדה, מיקרוסקופ לנתח יכול להיות ממוקם בתוך מכסה מנוע רקמת סטרילית התרבות.
הניתוח histopathologic של תרבויות איברים לאחר ההדבקה עם הפתוגן רלוונטי מבחינה רפואית L. חיידקים, מוצגים כאן כיישום אפשרי אחד של הפרוטוקול. לוקליזציה immunofluorescence של שני החיידקים ותאי מארח חיסון לאחר תובנה חדשות תשואות זיהום לתוך תגובת המארח האנושית לפתוגנים. תרבויות איבר Decidual עשויות לשמש כטכניקת ניסוי vivo לשעבר משלימה לבחון נתונים שנוצרו מזיהומי עכבר vivo, לרבות דוחות מסקרן מראים פגמי תפקידי מערכת מקרופאג decidual murine 26,27. בנוסף, org אדםניתן השתמשו תרבויות אסטרטגיות מעורבת-זיהום, כגון בידוד תחרותי מורכב מכמה זני isogenic של L. חיידקים. זיהום תחרותי של תרבויות איברים הוא דרך רגישה לבדוק את הרלוונטיות של גורמים ארסיים בתוך הפונדקאי האנושי. אחת אילוץ של שיטה זו הוא כדאיות רקמות, אשר מוגבל לתרבות לטווח קצר (96 שעות עבור תרבויות villous, 72 שעות עבור תרבויות decidual). זה אידיאלי עבור זיהום עם גדל מהר חיידקים כגון L. חיידקים, אך בתרבויות עוד עשויים להיות נחוצים עבור פתוגנים כי לוקחים יותר זמן להקים ולהפיץ דרך רקמות.
כדי להפחית את הנטל העולמי של סיבוכי הריון, מחקר חייב להתמקד בהבנת פתופיזיולוגיה של ממשק האם והעובר האדם. חיידקים, פטריות, ופתוגנים ויראלי החוצות מאם לעובר גורם הרסני סיבוכים של הריון וזיהום עוברי. מבוקרת זיהום vivo של Ani מעבדהיונקים בדרך כלל נחשבים תקן הזהב לטיפול איך פתוגנים ליישב ולמעבר בין איברי 28. בגלל האנטומיה השליה משתנה במידה ניכרת על פני מינים של יונקים, זה הוא בעל חשיבות עליונה לשלב רקמה אנושית לתוך אסטרטגיות מחקר. תרבויות אדם איבר villous ו decidual הן מאוד מערכות מודל רלוונטיות לחקור אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן. כדי ללמוד עדיין חיוניים זה לא ידוע ולא מובנים איברים, חוקרים יכולים לנצל את השפע של שליה אנושית מושלכת אחר ודגימות decidual, באמצעות אסטרטגיות תרבות איבר כזה כפי שמתואר כאן.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Cristina Faralla and David Lowe for helpful discussions. We acknowledge Mark Weinstein and San Francisco General Hospital Pathology Department for expert advice. This work was supported by National Institute of Health grants R01AI084928 and Burroughs Wellcome Fund 41259 to A.I.B; G.A.R. was supported by F32AI108195, Society for Pediatric Pathology Young Investigator Research grant, and University of California Partnerships for Faculty Diversity President’s Post-doctoral Fellowship.
Materials
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4in, 1×2 0.5mm, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4in, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 mL conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10X Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10X PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1000X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 mL Ethanol and adding 34.3 mL PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 mL ethanol and adding 40 mL PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert – 30mm diameter, 0.4μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~300μL aliquotsin the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23 (2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. . Pathology of the Human Placenta. , (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods in enzymology. 236, 405-420 (1994).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. . The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I. Pathogens and the placental fortress. Current opinion in microbiology. 15, 36-43 (2012).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66 (2006).
