الثقافات المشيمة وساقطي الجهاز الإنسان لدراسة العدوى في واجهة الأم والجنين
Summary
ووصف وهناك طريقة بسيطة لإنشاء المشيمة الإنسان الأساسية (زغابي) والثقافات الجهاز الساقطة. الثقافات الجهاز زغبي والساقطية هي أدوات لا تقدر بثمن لدراسة المرضية في واجهة الإنسان الأم والجنين. ويتجلى العدوى ببكتيريا الليستيريا الخلايا اللستيريا الاختيارية.
Abstract
تظهر المشيمة على درجة كبيرة من التباين التشريحي بين الأنواع. لفهم أفضل البيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية من المشيمة البشرية، لا بد من تصميم التجارب باستخدام الخلايا البشرية والأنسجة. ميزة من الثقافة الجهاز هو الحفاظ على ثلاثي الأبعاد (3D) التنظيم الهيكلي والمصفوفة خارج الخلية. والهدف من هذا الأسلوب هو موضح هنا هو نجاح إنشاء فيفو السابقين الثقافات الحمل هيئة الأنسجة البشرية وعلى صيانة ثقافة صحية لل72-96 ساعة. تفاصيل بروتوكول لمعالجته فورا من البحوث وافق، المشيمة والعينات الساقطية جديدة من جناح التشغيل. هذه هي عينات وفيرة إلا سيتم التخلص منها. تعليمات مفصلة حول جمع عقيمة من هذه العينات، بما في ذلك تفاصيل الشكلية على كيفية اختيار الأنسجة المناسبة لإقامة الثقافات الجهاز 3D، يتم توفيرها. وmicrodissected الأنسجة زغبي والساقطية المشيمة إلى 2-3 مم 3 قطعوضعت بشكل منفصل على مرشحات transwell مبطنة مصفوفة ومثقف لعدة أيام. زغابي والثقافات الجهاز الساقطية مناسبة تماما للدراسة البشري التفاعل المضيف الممرض. بالمقارنة مع الكائنات نموذج أخرى، فإن هذه الثقافات الإنسانية هي مفيدة بشكل خاص لدراسة آلية العدوى لمسببات الأمراض التي تظهر أنماط مختلفة من خصوصية المضيف. وكمثال على ذلك، علينا أن نظهر إصابة الثقافات الجهاز المشيمة والساقطية مع الاختيارية البكتيريا الممرضة المستوحدة الليستيريا ذات الصلة سريريا، داخل الخلايا.
Introduction
العدوى والالتهاب في واجهة الأم والجنين يمثل مصدرا رئيسيا للمراضة والوفيات في النساء والأطفال. فهم كيف تصيب الجراثيم هذه الأنسجة أمر بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات جديدة لمنع وعلاج الأمراض مثل الولادة المبكرة ووفاة الجنين. ومع ذلك، بين الأنواع عالية التباين واجهة الأم والجنين يعقد التحقيق التجريبي. وعلاوة على ذلك، تظهر مسببات الأمراض الأكثر الميكروبية خصوصية العائل، وبالتالي العديد من النماذج الحيوانية لا يمكن أن ألخص تماما الأمراض المعدية الإنسان. بعض الكائنات الحية (المستدمية النزلية، السالمونيلا التيفية، ضمة الكوليرا، والعديد من الآخرين) هي المسببة للأمراض بدقة في البشر، في حين أن البعض الآخر، مثل الليستريا الليستيريا، وعلى مستوى أكثر وسيطة من خصوصية المضيف 1. وقد تم توثيق خصوصية المضيف في كثير من جوانب المرضية، بما في ذلك الاستعمار 2، 3 نشر والتهرب المناعة 4 </sتصل>، واقتناء المواد الغذائية 5. وبالتالي، فإنه من الأهمية بمكان لتحديد أنظمة نموذج المضيف الأمثل.
يتألف من خلايا الجنين ودم الأم، والمشيمة هي العضو الذي يتطور بسرعة على مدار الحمل 6. في أبسط شروط، هي التي شيدت المشيمة البشرية هياكل تشبه شجرة "زغبي" الجنين استحم في دم الأم. الغاز وتبادل المغذيات يحدث عبر طبقات الخلايا الجنينية متخصصة تسمى أرومة مغذية التي تبطن السطح من أشجار زغبي. بطانة الرحم المخاطية الأمهات، وصف بطانة الرحم في الأنثى غير الحوامل، يحول هيكليا ووظيفيا في الساقط لاستيعاب وحدة جنيني مشيمي. وترسو الأشجار زغبي إلى الرحم عن طريق أرومة مغذية extravillous (EVT) التي تهاجر من ترسيخ أعمدة خلية في الساقط. واجهة الأم والجنين، وبالتالي، يتكون من الساقط والمشيمة.
ووصفت تقنية زراعة الأعضاء هناوقد استخدمت لدراسة أين وكيف سريريا مسببات الأمراض البشرية ذات الصلة، بما في ذلك L. monocytogene الصورة والتوكسوبلازما، عبور الحاجز المشيمي 2،7. هذه الثقافات جهاز خارج الجسم الحي تكرار في الهندسة المعمارية أنسجة الجسم الحي، وهي نظم نموذج يمكن القول من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة للغاية لالمشيمة البشرية. وتشمل تقنيات زراعة إضافية إإكسبلنتس كامل الجهاز، شرائح الجهاز، والأنسجة أو وقف organoids خلية جزءا لا يتجزأ في 3D مصفوفة. لمزيد من التفاصيل حول هذه الخيارات، يرجى الرجوع إلى استعراض حديث شامل 8. يرجى ملاحظة أن هذا البروتوكول هو لثقافة منفصلة من الساقط والزغب المشيمي. لدراسة التفاعل بين الخلايا المشيمة والخلايا الساقطة، قد يكون من المفضل تقنية ثقافة مشتركة. نشير القارئ المهتم إلى تقنية المشارك ثقافة زغابي ساقطي سبق وصفها، وتستخدم من قبل الباحثين الذين يدرسون بوساطة الأرومة الغاذية ساقطي إعادة الأوعية الدموية 9-11.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن الفطرية، المعدلة وراثيا والماوس خروج المغلوب سلالات يخدم في النظم التجريبية لاختبار بقوة الآليات. ومع ذلك، على الرغم من الحفظ العام للمادة الوراثية الأساسية، والجينوم وظيفية لدى الفئران والبشر تظهر اختلافات كبيرة في العناصر التنظيمية 23. وليس من المستغرب، لذلك، وأحيانا لا تلخيصها أن الدراسات قبل السريرية واعدة في النماذج الحيوانية في المرضى من البشر. معارض المشيمة التنوع بين الأنواع عالية جدا، مما يجعل نماذج حيوانية أقل من مثالية لدراسة الأمراض التي تصيب البشر 24. يعترف كل من اختلافات ملحوظة في علم المناعة البشرية والفأر 25، وتطور متباينة وضوحا في علم التشريح المشيمة، فإنه من الحكمة أن تنظر في استخدام خارج الجسم الحي الثقافات الجهاز من أنسجة الحمل الإنسان للتحقيق التجريبي.
والوصف، والصور الفوتوغرافية، والفيديو التعليمي في هذا البروتوكول إرشاد الباحثين علىكيفية إنشاء زغابي والثقافات الجهاز الساقطة على إدراج زراعة الأنسجة transwell ECM المغلفة. وتشمل مزايا هذه التقنية البساطة النسبية للتشريح الصغيرة والميكانيكية نظام الدعم transwell، لا سيما بالمقارنة مع الطرق البديلة مثل المصفوفات جزءا لا يتجزأ 3D أو الثقافات الجهاز شريحة. تعليق الثقافة الجهاز على دعم غشاء يسمح لتبادل المواد الغذائية في جميع الأسطح الأنسجة ويتم الحفاظ على استمرارية للثقافة على المدى القصير (96 ساعة للثقافات زغبي، 72 ساعة للثقافات الساقطية)، وهذا الأسلوب يسمح لدراسة البيولوجيا المشيمة البشري في الأنسجة مستوى، لا يمكن إنكاره أكثر بيولوجيا من النماذج ثقافة الخلية أحادي الطبقة.
الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو تشريح الصغير من القطع زغبي والساقطية المناسبة للثقافة الجهاز. وأظهرت قطع المثلى من الأنسجة فوتوغرافيا (الشكل 2A) والشكل (3A) لمساعدة الباحثين الذينالتصور العينات الحمل هو جديد. من المهم بصفة خاصة لتحديد الأشجار زغبي التي تنتهي في الأعمدة EVT الفروع، وهذه الخلايا سوف يهاجر إلى ECM وتساعد على ترسيخ الزغب إلى الغشاء. لكلا النوعين من الثقافات الجهاز مفيد للحد من الاضطرابات في الأنسجة خلال التغييرات وسائل الإعلام من قبل pipetting بطريقة متأنية وتؤدة.
تقدم هذه التقنية سوى الحد الأدنى من الصعوبات. في بعض الأحيان، تظهر العينات التلوث. التلوث هو عادة البكتيري (في بعض الأحيان بولي للميكروبات)، وإلا يصبح واضحا بعد 1-2 أيام في الثقافة. مرة واحدة لوحظ تلوث، ينبغي أن تطبق التبييض، وثقافة التخلص منها، ونسيج الثقافة الحاضنة تعقيمها لمنع مشكلة على المدى الطويل. هناك عدة طرق ممكنة قد تنشأ التلوث: في عدوى الرحم، أثناء الجراحة، خلال العينات الحصاد / المعالجة، أو أثناء الصيانة الثقافة الجهاز. الخطوات الحصاد والتجهيز والوقت على الأرجحومكان للتلوث لإدخالها. وبالتالي، فمن المهم للحد من مقدار الوقت يتم التلاعب العينة خلال جمع وتشريح الصغيرة. وهذا سوف يقلل التعرض العينة إلى المحيط والبيئة غير معقمة. اعتمادا على إعداد المختبر، ومجهر تشريح يمكن أن يكون موجودا داخل المعقم نسيج الثقافة هود.
تحليل الإمراضية الثقافات الجهاز بعد العدوى مع الممرض ذات الصلة طبيا L. اللستيريا، ويظهر هنا كما طلب واحد ممكن من البروتوكول. توطين المناعي من كل من البكتيريا والخلايا المناعية بعد عوائد العدوى رؤى جديدة لاستجابة المضيف الإنسان لمسببات الأمراض. الثقافات الجهاز الساقطية قد تكون بمثابة فيفو السابقين تقنية التجربة مكملة لدراسة البيانات التي تم إنشاؤها من المجراة العدوى الماوس، بما في ذلك تقارير مثيرة للاهتمام تظهر العيوب في وظائف الدفاع بلعم الساقطية الفئران 26،27. بالإضافة إلى ذلك، غزاله البشريعلى الثقافات يمكن استخدامها في استراتيجيات مختلط العدوى، مثل اللقاح تنافسية تتألف من عدة سلالات إسوي من L. الليستريا. عدوى تنافسية الثقافات الجهاز هو وسيلة حساسة لاختبار مدى ملاءمة عوامل الفوعة داخل المضيف البشري. القيد واحد من هذا الأسلوب هو بقاء الأنسجة، والذي يقتصر على ثقافة على المدى القصير (96 ساعة للثقافات زغبي، 72 ساعة للثقافات الساقطية). هذا هو المثل الأعلى للعدوى بالميكروبات سريعة النمو مثل L. اللستيريا، ولكن الثقافات أطول قد تكون ضرورية لمسببات الأمراض التي يستغرق مزيدا من الوقت لإنشاء وينتشر عن طريق الأنسجة.
للحد من العبء العالمي للمضاعفات الحمل، يجب أن تركز البحوث على فهم الفيزيولوجيا المرضية واجهة الإنسان الأم والجنين. بكتيرية أو فطرية، ومسببات الأمراض الفيروسية التي تعبر من الأم إلى الجنين قضية المدمرة مضاعفات الحمل وعدوى الجنين. التحكم في العدوى فيفو العاني مختبريعتبر ملس عادة المعيار الذهبي لمعالجة كيفية استعمار مسببات الأمراض والعبور بين الأجهزة 28. لأن التشريح المشيمة يختلف بشكل ملحوظ في كل أنواع الثدييات، فإنه من الأهمية بمكان أن تدمج الأنسجة البشرية في استراتيجيات البحوث. الثقافات الجهاز زغبي والساقطية الإنسان هي أنظمة النموذجية ذات الصلة للغاية لتحقيق التفاعلات المضيف الممرض. لدراسة هذا الجهاز الحيوي بعد مفهومة، يمكن للباحثين الاستفادة من وفرة من المشيمة البشرية التخلص منها خلاف ذلك، والعينات الساقطة، وذلك باستخدام استراتيجيات الثقافة الجهاز مثل كما هو موضح هنا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Cristina Faralla and David Lowe for helpful discussions. We acknowledge Mark Weinstein and San Francisco General Hospital Pathology Department for expert advice. This work was supported by National Institute of Health grants R01AI084928 and Burroughs Wellcome Fund 41259 to A.I.B; G.A.R. was supported by F32AI108195, Society for Pediatric Pathology Young Investigator Research grant, and University of California Partnerships for Faculty Diversity President’s Post-doctoral Fellowship.
Materials
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4in, 1×2 0.5mm, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4in, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 mL conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10X Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10X PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1000X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 mL Ethanol and adding 34.3 mL PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 mL ethanol and adding 40 mL PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert – 30mm diameter, 0.4μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~300μL aliquotsin the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23 (2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. . Pathology of the Human Placenta. , (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods in enzymology. 236, 405-420 (1994).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. . The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I. Pathogens and the placental fortress. Current opinion in microbiology. 15, 36-43 (2012).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66 (2006).
