Summary

脱分化脂肪細胞を得るために効率的な方法

Published: July 15, 2016
doi:

Summary

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Abstract

組織工学や細胞治療は、臨床的に偉大な約束を保持します。この点に関して、このような間葉系幹細胞(MSC)のような多能性細胞は、損傷した器官に機能を回復するために、近い将来に、治療的に使用することができます。それにもかかわらず、MSCおよびそれらの増幅を囲む非効率を単離する高度に侵襲的な手順を含むいくつかの技術的な問題は、現在、これらの治療法の潜在的な臨床使用を妨げます。ここで、我々は、脱分化脂肪細胞(DFAT)、MSC様細胞の生成のための非常に効率的な方法をご紹介します。興味深いことに、DFAT細胞が脂肪生成、骨形成、および軟骨細胞を含むいくつかの細胞型に分化することができます。他のグループが以前に成熟した脂肪組織からDFAT細胞を生成するための様々な方法を提示しているが、我々の方法は、私たちはより効率的にDFAT細胞を産生することができます。この点において、我々は、20%FBSを補充したものDFAT培地(DCM)を実証します20%FBSを補充したDMEMよりDFAT細胞を、生成においてより効果的です。さらに、我々の細胞培養法で製造DFAT細胞は、いくつかの組織型に再分化することができます。このように、組織の脱分化の研究のために非常に興味深く、有用なモデルが提示されています。

Introduction

細胞治療および組織工学、再生医療1-5の分野におけるホットなトピックです。これらの治療法は偉大な約束を保持している間、いくつかの技術的な問題は、現在、その臨床使用を妨げます。この点において、iPS細胞の生成のように、すべての組織工学的療法は、患者の安全性を維持するために、外部遺伝子形質導入を含まない細胞を産生しなければなりません。したがって、我々が正常に人間DFAT細胞6を生成するために最初のグループでした。いくつかの他の研究グループがいるので、さらに我々のモデルの有用性を強調し、哺乳動物起源7-9のDFAT細胞を生成するために私たちの方法を採用しています。

いくつかの研究の過程で、我々は、細胞培養環境の質は、細胞培地の含有量を調整することによって修正することができることを見出しました。この知見は、DFAT細胞の産生および改善された細胞質の成功率の増加につながっています。両方の重要な要素で効率的に将来の臨床試験のための細胞を生成します。この点に関して、改善されたDFAT培地中で(DCM、組換えヒトインスリンを含有する細胞培地、血清アルブミン、L-グルタミン酸、いくつかの脂肪酸、およびコレステロール幹間葉する媒体と同様)とDFAT細胞の生成のための方法および増殖は、(DCMの内容の詳細は、リクエストに応じて入手可能です)を開発しました。使用して、この方法の高品質DFAT細胞が脂肪生成、骨形成、および軟骨細胞を含むいくつかの細胞型に分化する能力を生成しました。要するに、この検証済みの細胞培養プロトコルはDFAT細胞の質を高め、細胞治療および組織工学の臨床応用性を高めるために非常に有用であり得ます。

Protocol

人間の皮下脂肪のサンプルは、形成外科、泌尿器科、小児外科と日本大学板橋病院(東京、日本)の整形外科の部門で手術を受ける患者から得ました。患者は書面によるインフォームドコンセントを与えた、と医学の倫理委員会日本大学の学校は研究を承認しました。 1.組織標本研究室に手術室からの組織サンプルを持参してください。 一旦室温(RT)で?…

Representative Results

本研究では、DFAT細胞の生成のための方法およびツールキットは、( 図1)に向上しました。我々の方法は、私たちは、DCMおよび20%FBS( 図2A)を含むDMEM培地の両方を使用してDFAT細胞を生成することができます。このように、我々はDFAT細胞を生成するDCMとDMEMの効率を比較しました。この点で、DCMにかかわらず、脂肪細胞の数( 図2A<…

Discussion

インビトロ脱分化天井文化として知られているプロセスを経る成熟脂肪細胞は、より原始的な表現型に復帰し、増殖能力を得てもよいです。これらの細胞は、以下のように脱分化脂肪(DFAT)細胞と呼ばれます。 DFAT細胞の多分化能を評価しました。分析および遺伝子発現のフローサイトメトリー分析DFAT細胞のASC 6と比較して非常に均質であったことを明らかにしまし?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported in part by Program for Creating Start-ups from Advanced Research and Technology (START Program) from the Japan Society for the Promotion of Science (ST261006IP, TM) and by Program for the Strategic Research Foundation at Private Universities (2014-2019) (S1411018, TM) from the Ministry of Education, Sports, Science and Technology.

Materials

CSTI303-MSC medium  CSTI 87-671 This medium is defined as DCM in the text
PBS(-) Wako 166-23555 It does not contain Mg2+ and Ca2+
DMEM medium Gibco 11965-092
Fetal Bovine Serum Sigma 172012
Collagenase type II Sigma C-6885
Scissors Takasago Medical Industry Co., Ltd TKZ-F2194-1
Shaker TAITEC Bioshaker V.BR-36
Falcon Cell Strainer 100um Yellow CORNING LIFE SCIENCES  DL 352360
Falcon 12.5cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap CORNING LIFE SCIENCES  353107
18G needle NIPRO 02-002
20ml Syringe  NIPRO 08-753
Z Series Coulter Counter BECKMAN COULTER 383550

References

  1. Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
  2. de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new “cells as drugs” paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
  3. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
  4. Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
  5. Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
  6. Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
  7. Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
  8. Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065 (2015).
  9. Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651 (2015).
  10. Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
  11. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).

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Cite This Article
Taniguchi, H., Kazama, T., Hagikura, K., Yamamoto, C., Kazama, M., Nagaoka, Y., Matsumoto, T. An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells. J. Vis. Exp. (113), e54177, doi:10.3791/54177 (2016).

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