subtipificación de<em> Campylobacter jejuni</em> Ssp.<em> doylei</em> El uso de aislamientos PhyloProteomics basados en espectrometría de masas (MSPP)
Summary
Se utilizó phyloproteomics basados en espectrometría de masas (MSPP) para escribir una colección de Campylobacter jejuni ssp. Doylei aislamientos a nivel de cepa en comparación con la tipificación de secuencia de multilocus (MLST).
Abstract
MALDI-TOF MS ofrece la posibilidad de diferenciar algunas bacterias no sólo a nivel de especies y subespecies, sino incluso por debajo, a nivel de cepa. isoformas alélicas de los iones detectables de biomarcadores resultan en desplazamientos en masa aislante específica. phyloproteomics de masas basado en la espectrometría (MSPP) es una nueva técnica que combina las masas de espectrometría de masas de biomarcadores detectables en un esquema que permite la deducción de las relaciones phyloproteomic de los cambios de masa específica del aislante en comparación con un genoma secuenciado cepa de referencia. Las secuencias de aminoácidos deducidas se utilizan entonces para calcular dendrogramas basados en MSPP.
A continuación se describe el flujo de trabajo del MSPP escribiendo un ssp Campylobacter jejuni. Doylei colección aislado de siete cepas. Todos los siete cepas eran de origen humano y la secuencia de multilocus (MLST) demostrado su diversidad genética. MSPP tipificación resultó en siete diferentes tipos de secuencias del MSPP, lo que refleja suficientemente su grafíalas relaciones logenetic.
El C. jejuni ssp. doylei esquema MSPP incluye 14 diferentes iones de biomarcadores, proteínas ribosomales en su mayoría en el rango de masa de 2 a 11 kDa. MSPP puede, en principio, ser adaptado a otras plataformas de espectrometría de masa con un rango de masa extendida. Por lo tanto, esta técnica tiene el potencial de convertirse en una herramienta útil para la tipificación microbiana nivel de cepa.
Introduction
Durante la última década, láser asistida por matriz de desorción ionización de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) ha avanzado a ser un método estándar de gran valor para el género microbiano y la identificación de las especies en microbiología clínica 1, 2. La identificación de especies se basa en el registro de huellas digitales pequeñas proteínas de las células intactas o lisados celulares. El rango de masa típica de un espectrómetro de masas utilizado en microbiología clínica habitual es de 2-20 kDa. Además, el espectro resultante se puede utilizar para discriminar las cepas en las siguientes especies y de nivel 3 por debajo de la subespecie. Los primeros estudios pioneros han identificado iones de biomarcadores específicos para un subgrupo particular de las cepas de Campylobacter jejuni en 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9, y EScherichia coli 10 – 12.
La combinación de varias masas de biomarcadores variables correspondientes a las isoformas alélicas ofrece la opción para los subtipos más profundo. Anteriormente, hemos implementado con éxito un método para convertir estas variaciones en los perfiles de masas en relaciones significativas y reproducibles phyloproteomic llamados phyloproteomics basados espectrometría de masas (MSPP) en un C. ssp jejuni. colección aislado jejuni 13. MSPP se puede utilizar una de espectrometría de masa equivalente a las técnicas de subtipificación basada en la secuencia de ADN como la secuencia de mecanografía multilocus (MLST).
Especies de Campylobacter son la principal causa de gastroenteritis bacteriana en todo el mundo 14, 15. Como consecuencia de la campilobacteriosis sequela post-infecciosa, a saber, el Síndrome de Guillain Barré, artritis reactiva y enfermedad inflamatoria intestinal puede surgir 16. Las principales fuentes de infección sonla carne de ganado contaminado de pollo, pavo, cerdos, vacas, ovejas y patos, la leche y la superficie del agua 15, 17. Por lo tanto, los estudios de vigilancia epidemiológica regulares en el contexto de la seguridad alimentaria son necesarias. MLST es el "patrón oro" en la tipificación molecular de especies de Campylobacter 18. Debido a que el método de Sanger de secuenciación basada MLST es un trabajo intensivo, que consume tiempo y es relativamente caro, MLST datos está restringido a cohortes relativamente pequeñas aisladas. Por lo tanto, hay una necesidad de métodos de subtipificación más baratos y más rápidos. Esta necesidad podría satisfacerse mediante métodos de espectrometría de masas como MSPP.
En este trabajo se presenta un protocolo detallado para MSPP tipificación usando una colección de Campylobacter jejuni ssp. Doylei aislamientos y la comparación de su potencial con MLST.
Protocol
Representative Results
Discussion
El paso más crítico en el establecimiento de un régimen de MSPP es la determinación genética inequívoca de las identidades de iones de biomarcadores. Si no es posible identificar un biomarcador, sin duda, entonces debe ser excluido del régimen 13.
El C. ssp. doylei esquema jejuni incluye 14 diferentes iones de biomarcadores. Estos son 5 menos en comparación con la C. jejuni ssp. esquema de jejuni MSPP 13 .La diferenci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Hannah Kleinschmidt for excellent technical support. This paper was funded by the Open Access support program of the Deutsche Forschungsgemeinschaft and the publication fund of the Georg August Universität Göttingen.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 34967 | |
| Autoflex III TOF/TOF 200 system | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | GT02554 G201 | Mass spectrometer |
| bacterial test standard BTS | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604537 | |
| BioTools 3.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 263564 | Software Package |
| Bruker IVD Bakterial Test Standard | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8290190 | 5 tubes |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8843 | ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9143 | Goossens Z90 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG7790 | ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9243 | Goossens N130 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8871 | NCTC A603/87 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9255 | Goossens B538 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8870 | NCTC A613/87 |
| Columbia agar base | Merck, Darmstadt, Germany | 1.10455 .0500 | 500 g |
| Compass for FlexSeries 1.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 251419 | Software Package |
| defibrinated sheep blood | Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany | SR0051 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 02854 Fluka | |
| formic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | F0507 | |
| HCCA matrix | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604531 | |
| Kimwipes paper tissue | Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z188956 | |
| MALDI Biotyper 2.0 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 259935 | Software Package |
| Mast Cryobank vials | Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany | CRYO/B | |
| MSP 96 polished steel target | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 224989 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
| recombinant human insulin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I2643 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | T6508 | |
| water, molecular biology-grade | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | W4502 |
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