Subtyping von<em> Campylobacter jejuni</em> Ssp.<em> doylei</em> Massen Isolaten Spectrometry-basierte PhyloProteomics (MSPP)
Summary
Die Massenspektrometrie-basierte phyloproteomics (MSPP) wurde verwendet , um eine Sammlung von Campylobacter jejuni ssp geben. Doylei isoliert auf Stammebene im Vergleich zu multilocus Sequenz Typisierung (MLST).
Abstract
MALDI-TOF-MS bietet die Möglichkeit, einige Bakterien nicht nur auf die Art und Unterart Ebene zu unterscheiden, sondern auch unten auf Stammebene. Allelische Isoformen der nachweisbaren Biomarker-Ionen führen zu Isolat-spezifische Massenverschiebungen. Die Massenspektrometrie-basierte phyloproteomics (MSPP) ist eine neuartige Technik, die die massenspektrometrische nachweisbar Biomarkers Massen in einem System kombiniert, das Abzug von phyloproteomic Beziehungen von Isolat spezifischen Massenverschiebungen im Vergleich zu einem Genom-Referenzstamm sequenziert werden kann. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden dann verwendet, MSPP Basis Dendrogramme zu berechnen.
Hier beschreiben wir den Workflow von MSPP durch eine Campylobacter jejuni ssp eingeben. Doylei Isolat Sammlung von sieben Stämme. Alle sieben Stämme waren menschlichen Ursprungs und multilocus Sequenz Typisierung (MLST) ihre genetische Vielfalt unter Beweis gestellt. MSPP-Typisierung ergab sieben verschiedene Typen MSPP Sequenz, ausreichend ihre phy reflektierendenlogenetic Beziehungen.
Die C. jejuni ssp. doylei MSPP Schema 14 verschiedene biomarker Ionen enthält, meistens ribosomalen Proteine in dem Massenbereich von 2-11 kDa. MSPP kann im Prinzip, mit einem erweiterten Massenbereich zu anderen massenspektrometrischen Plattformen angepasst werden. Daher hat diese Technik das Potenzial, ein nützliches Werkzeug für die Stammebene mikrobielle Typisierung zu werden.
Introduction
Während des letzten Jahrzehnts, Matrix-assistierte Laser – Desorptions – Ionisations -Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF – MS) fortgeschritten in der klinischen Mikrobiologie 1, ein hoch geschätzter Standardmethode zur mikrobiellen Gattung und Art Identifizierung zu sein 2. Spezies Identifizierung wird auf die Aufzeichnung von kleinen Protein Fingerabdrücke von intakten Zellen oder Zell-Lysaten basiert. Der typische Massenbereich für eine Masse in der klinischen Routine Mikrobiologie verwendeten Spektrometer 2-20 kDa. Zusätzlich kann die resultierenden Spektren verwendet werden , Stämme bei den unten Spezies und unter subspecies Ebene 3 zu unterscheiden. Frühe Pionier Studien haben spezifische Biomarker – Ionen für eine bestimmte Untergruppe von Stämmen in Campylobacter jejuni 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica Serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7 bis 9, und Escherichia coli 10 bis 12.
Die Kombination mehrerer variabler Biomarkers Massen allelische Isoformen entsprechenden bietet die Möglichkeit, für tiefere Subtyping. Früher führten wir erfolgreich eine Methode , um diese Variationen in Massenprofile in aussagekräftige und reproduzierbare phyloproteomic Beziehungen Massenspektrometrie phyloproteomics (MSPP) auf einem C genannt zu konvertieren jejuni ssp. jejuni – Isolat Sammlung 13. MSPP eine massenspektrometrische äquivalent zu DNA-Sequenz basiert Subtyping Techniken wie multilocus Sequenz Typisierung (MLST) verwendet werden.
Campylobacter – Arten sind die Hauptursache von bakterieller Gastroenteritis weltweit 14, 15. Als Folge der Campylobacteriosis postinfektiöse sequela, nämlich Guillain Barré – Syndrom, reaktive Arthritis und entzündlicher Darmerkrankung kann 16 entstehen. Die Hauptinfektionsquellen sindkontaminiertes Tierfleisch aus Huhn, Pute, Schwein, Rind, Schaf und Enten, Milch und Oberflächenwasser 15, 17. regelmäßige epidemiologische Überwachung Studien im Zusammenhang mit der Lebensmittelsicherheit sind daher notwendig. MLST ist der "Goldstandard" in der molekularen Typisierung für Campylobacter – Arten 18. Weil die Sanger-Sequenzierung basiert MLST Verfahren ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig und relativ teuer ist MLST typing auf relativ kleine Isolat Kohorten beschränkt. Daher besteht ein Bedarf an preiswerter und schneller Subtypisierung Methoden. Dieser Bedarf könnte durch massenspektrometrische Methoden wie MSPP erfüllt werden.
In diesem Beitrag wird ein ausführliches Protokoll für MSPP-Typisierung eine Sammlung von Campylobacter jejuni ssp. Doylei Isolate und Vergleich seines Potentials mit MLST.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der wichtigste Schritt bei der Einrichtung eines MSPP Regelung ist die eindeutige genetische Bestimmung von Biomarkern Ionen-Identitäten. Wenn es nicht möglich ist , einen Biomarkers zweifellos zu identifizieren, dann sollte es aus dem Schema 13 ausgeschlossen.
Die C. jejuni ssp. doylei Schema enthält 14 verschiedene Biomarker – Ionen. Diese sind 5 weniger im Vergleich zu dem C. jejuni ssp. jejuni MSPP Schema 13 .Die wesentlichste …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Hannah Kleinschmidt for excellent technical support. This paper was funded by the Open Access support program of the Deutsche Forschungsgemeinschaft and the publication fund of the Georg August Universität Göttingen.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 34967 | |
| Autoflex III TOF/TOF 200 system | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | GT02554 G201 | Mass spectrometer |
| bacterial test standard BTS | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604537 | |
| BioTools 3.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 263564 | Software Package |
| Bruker IVD Bakterial Test Standard | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8290190 | 5 tubes |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8843 | ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9143 | Goossens Z90 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG7790 | ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9243 | Goossens N130 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8871 | NCTC A603/87 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9255 | Goossens B538 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8870 | NCTC A613/87 |
| Columbia agar base | Merck, Darmstadt, Germany | 1.10455 .0500 | 500 g |
| Compass for FlexSeries 1.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 251419 | Software Package |
| defibrinated sheep blood | Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany | SR0051 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 02854 Fluka | |
| formic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | F0507 | |
| HCCA matrix | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604531 | |
| Kimwipes paper tissue | Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z188956 | |
| MALDI Biotyper 2.0 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 259935 | Software Package |
| Mast Cryobank vials | Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany | CRYO/B | |
| MSP 96 polished steel target | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 224989 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
| recombinant human insulin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I2643 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | T6508 | |
| water, molecular biology-grade | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | W4502 |
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