EAK 16-II ile FACS Arıtılmış Timik Epitel Hücreleri 3-D Toplama Teşvik / EAKIIH6 Kendi toplanan Hidrojel
Summary
This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.
Abstract
Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.
Introduction
Timus edinilmiş bağışıklık sisteminin işlevi için önemlidir patojen reaktif, kendine dayanıklı T hücrelerinin çeşitli nüfusun oluşturulması için primer lenfoid organıdır. Bu timik stroma sünger benzeri üç boyutlu (3-D) matris boyunca göç, gelişmekte olan timositleri, lenfosit progenitör hücreler olarak kemik iliğinden göç dinamik bir organdır, soy-şartname ve farklılaşma tabi, ve sonunda da göç olgun T hücreleri. bu iyi programlanmış sürecin başarısı büyük ölçüde göç timositlerde ve konut timik epitel hücreleri (Tecs) kurulması ve timus mikroçevresinin bütünlüğünü korumak için gerekli olan timik stroma baskın nüfus arasındaki çapraz konuşma bağlıdır.
anatomik bir konumda ve eşsiz fonksiyon esas alınarak, TECS iki alt ayrılabilir: kortekste Tecs yanıtlayabiliyor olan (cTECs)Kendi kendine MHC (majör histokompatibilite kompleks) seçilmesi olan kişidir T hücreleri (pozitif seçim) ve otoreaktif T hücreleri (negatif seçim) 1,2 ortadan kaldırmak için gerekli olan medullada Tecs (mTECs) yazılmıştır. Birçok faktör (örneğin, yaşlanma, enfeksiyon, radyasyon, ilaç tedavileri) tehlikeye adaptif bağışıklık sonuçlanan timik epitele geri dönüşü olmayan hasarlara neden olabilir. Çok sayıda girişimlerine rağmen, timus fonksiyonu yeniden nedeniyle timik mikro çoğaltmak zorluk zorlu olmuştur. 2-B ortamında kültürlenmiştir Tecs hızlı thymopoiesis 3,4 kritik genlerin ekspresyonunu azaltmak ise Özellikle, timik üç boyutlu (3-D) konfigürasyonu, Tecs hayatta kalma ve işlevi için önemlidir.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) ve C-ucu histidinylated analog EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH), düşük molekül ağırlıklı, deiyonize Su sağlama içinde çözünür olan amfifilik oligopeptitlerdir20 mM NaCI (insan vücut sıvısı normal tuz konsantrasyonunun 154 mM) daha yüksek iyonik güce maruz kaldığı zaman R, β-fibriller oluşturur jelleşme ama geçer. Bu çevre duyarlı özellik 3D yapıları oluşturmak üzere onları çok yönlü yapı taşlarını yapar. kompleksleri, protein ilaçları ve diğer biyomoleküllerin demirlemek için bir adaptör olarak hizmet verebilir (: EAKII-H6 üzerinde His-tag takma mekanizması, hangi anti-His IgG'ler / Fc bağlayıcı rekombinant protein A / G (pA / G αH6) sağlar örneğin hidrojel karma yapısını 5-8, antikorlar).
Daha önce hidrojel üzerine bağlanan flüoresan etiketli IgG molekülleri kadar 13 gün 9 enjeksiyon yerinde muhafaza edilebileceğini göstermiştir. ΑH6 Dahası,: Anti-CD4 IgG'lerin ile sabitlenen pA / G adaptörleri EAK16 II / EAKIIH6 (EAK) hidrojel ilave edildi, CD4 + T hücreleri, spesifik olarak 10 ele geçirildi. benzer bir teknik kullanılarak, yakın zamanda göstermiştir ki TECS C 3-D-çekiş(: PA / G: αEpCAM αH6) TEC-özel anti-EpCAM antikorları taşıyan adaptör kompleksleri ile EAK hidrojel terfi ould. Çıplak farelerin böbrek kapsülleri altına nakledildiklerinde, EAK hidrojel gömülü TEC kümeleri etkili in vivo 11,12 işlevsel T hücrelerinin gelişimini destekler.
Burada hızlı ve etkin bir floresan aktive hücre (FACS) ile Tecs arındırmak ve EAK hidrojel sistemi ile 3-D TEC agrega üretmek için bizim yöntemini gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
TECS timus stroma baskın nüfus ve timüs bezlerinin yapısı ve fonksiyonu için temel rolleri oynarken, onlar toplam timik sellülarite sadece yaklaşık 0.1-0.5% temsil etmektedir. Bunlar aynı zamanda, hücre ölümü, yüksek yüzdeleri zaman, yani, tedavi hücre dışı matrisin (ECM) ile ilgili Tecs ayırmak için, kollajenaz sindirimi aşağıdaki koşullar kırılgan hücrelerdir. Onların nadir (~ 200.000 fare timus başına) ve kırılganlık o TECS izole etmek zor bir görev yaptı. TEC izole yüks…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma R21 AI113000 (ATM) ve R01 AI123392 (YF) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen hibe desteklenmiştir.
Materials
| 1. TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1X PBS, 0.1% BSA, 2mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 mL RPMI-1640, 0.025 mg/mL Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/mL DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2cc U-100 Insulin syringe 28G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5mL Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100um Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Cell sorting | |||
| 5mL Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2uL per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10uL per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10uL per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. EAK gel assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5mL Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5mL microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10mg/mL | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5mg/mL | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5mM HEPES, 50uM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100X) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
