Summary

La promozione 3-D di aggregazione delle cellule FACS purificata timica epiteliali con EAK 16-II / EAKIIH6 autoassemblanti idrogel

Published: June 27, 2016
doi:

Summary

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Abstract

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

Introduction

Il timo è l'organo linfoide primaria responsabile per la generazione di una popolazione eterogenea di cellule T auto-tolerant patogeno-reattivo che è essenziale per la funzione del sistema immunitario acquisito. Si tratta di un organo dinamico dove timociti di sviluppo, immigrarono dal midollo osseo come cellule linfociti progenitrici, migrano attraverso il tridimensionale (3-D) a matrice spugnosa dello stroma timico, sottoposti lineage-specifiche e differenziazione, e infine emigrare maturo T-cellule. Il successo di questo processo ben programmato dipende in gran parte sul cross-talk tra i timociti migrazione e le cellule epiteliali del timo residenziali (TEC), la popolazione predominante dello stroma timica che sono essenziali per stabilire e mantenere l'integrità del microambiente del timo.

Sulla base della loro posizione anatomica e funzione unica, TEC può essere suddiviso in due sottoinsiemi: TEC nella corteccia (CTEC) che sono responbile per la selezione di auto-MHC (complesso maggiore di istocompatibilità) limitato cellule T (selezione positiva), e le TEC nella midollare (mTECs) che sono essenziali per eliminare le cellule T autoreattive (selezione negativa) 1,2. Molti fattori (ad esempio, l'invecchiamento, infezioni, irradiazione, droga trattamenti) possono causare danni irreversibili per l'epitelio timico, con conseguente compromissione immunità adattativa. Nonostante i numerosi tentativi, ripristinando la funzione timica è stata difficile a causa della difficoltà di riprodurre il microambiente timico. In particolare, timica tridimensionale (3-D) configurazione è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione del TEC, mentre TEC coltivate in un ambiente 2-D diminuire rapidamente l'espressione di geni critici per timopoiesi 3,4.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) e il suo C-terminale analogico histidinylated EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) sono a basso peso molecolare, oligopeptidi anfifilici che sono solubili in tardo deionizzatar, ma sottoposto gelificazione per formare beta fibrille quando esposto a forza ionica superiore a 20 mM NaCl (concentrazione salina normale in fluido corporeo umano è 154 mM). La struttura, situata reattivo ambientali li rende mattoni versatili per formare strutture in 3D. Il His-tag su EAKII-H6 fornisce un meccanismo di aggancio, con la quale gli anti-His IgG / Fc-legame proteina ricombinante A / G (αH6: pA / G) complessi possono servire come un adattatore per ancorare farmaci proteici e altre biomolecole ( ad esempio, anticorpi) sul idrogel composita 5-8.

Abbiamo precedentemente dimostrato che le molecole fluorescenti marcato IgG ancorate sul idrogel possono essere conservati al sito di iniezione per un massimo di 13 giorni 9. Inoltre, quando i αH6: adattatori pA / G ancorate con l'anti-CD4 IgG sono stati aggiunti al idrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK), cellule T CD4 + sono stati specificamente catturati 10. Usando una tecnica simile, abbiamo recentemente dimostrato che il 3-D aggregazione di TEC could essere promosso in EAK idrogel con complessi di adattamento che trasportano gli anticorpi anti-EpCAM specifici-TEC (αH6: PA / G: αEpCAM). Quando trapiantato sotto le capsule reni di topi nudi, i grappoli TEC incorporato in EAK idrogel possono supportare efficacemente lo sviluppo di cellule T funzionali in vivo 11,12.

Qui illustriamo il nostro metodo di rapido ed efficace purificare TEC con l'ordinamento delle cellule di fluorescenza-attivato (FACS) e generare aggregati TEC 3-D con il sistema EAK idrogel.

Protocol

Tutti gli animali utilizzati negli esperimenti sono stati alloggiati nella struttura animali a Allegheny-Singer Research Institute nell'ambito del protocollo esaminato e approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali del / Allegheny Singer Research Institute Allegheny Health Network. 1. digerire il timo con collagenasi Harvest timo. Euthanize 3-5 settimane di età topi C57BL6 / J in anidride carbonica (CO 2) da camera per raccogliere timo. Nel d…

Representative Results

Per esaminare l'efficacia di utilizzare il protocollo di separazione gradiente di densità per arricchire le cellule stromali CD45-, cellule raccolte sia l'interfaccia e il pellet di linfociti precipitati sono state colorate con anti-CD45 e anti-EpCAM. Entrambi anti-Ulex Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) e anticorpi anti-MHC di classe II sono stati inclusi anche nel cocktail colorazione per identificare ulteriormente i sottoinsiemi CTEC e MTEC. Come mostrato in Figura 1,</str…

Discussion

Mentre TEC sono la popolazione predominante dello stroma del timo e svolgono ruoli essenziali per la struttura e la funzione del timo, essi rappresentano solo circa il 0,1-0,5% della cellularità timica totale. Sono anche cellule fragili come alte percentuali di morte cellulare sono occasionalmente osservati dopo digestione collagenasi, cioè, il trattamento dissociare TEC dalla matrice extracellulare (ECM). La loro rarità (~ 200.000 al timo del mouse) e la fragilità reso un compito impegnativo per isolare TE…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health concede R21 AI113000 (WSM) e R01 AI123392 (YF).

Materials

1. TEC Isolation
70% Ethanol Decon Laboratories 2701(1 Gallon) Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straight Fine Science Tools, Inc. 91460-11
Graefe forceps, straight Fine Science Tools, Inc. 11053-10
Graefe forceps, curved Fine Science Tools, Inc. 11052-10
Washing solution 1X PBS, 0.1% BSA, 2mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline) Gibco 10010-023
BSA (Bovine serum albumin) Sigma A1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Invitrogen 15575-038
Digestion solution 9 mL RPMI-1640, 0.025 mg/mL Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/mL DNaseI
RPMI-1640 Gibco 11879-020
Liberase TM Research Grade Roche 05 401 127 001 referred as "purified collagenase"
1M HEPES Lonza 17-737E
Dnase I Roche 10 104 159 001
50mL Centrifuge tube Corning 430290
60mm tissue culture dish Falcon 353002
1/2cc U-100 Insulin syringe 28G1/2 Becton Dickinson 329461
5mL Polystyrene round-bottom tube Falcon 352058
5ml glass pipet Fisher Healthcare 13-678-27E Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotator Miltenyi 130-090-753
100um Cell strainer Falcon 352360
Density gradient medium: OptiPrep Axis-Shield
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell sorting
5mL Polypropylene round-bottom tube Falcon 352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) BD Biosciences 553142 Use as undiluted, 2uL per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 eBioscience 45-0451-80 Use at 1:150, 10uL per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE eBioscience 12-5791-82 Use at 1:100, 10uL per sample
BD Influx BD Biosciences
Single cell analysis software FlowJo
Name Company Catalog Number Comments
2. EAK gel assembly
Anti-His-Tag AnaSpec 29673 "anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) BioLegend 118202 "anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/G Pierce Biotechnology
1.5mL Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile Fisher Healthcare 05-402-24B referred as "1.5mL microcentrifuge tube" 
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid BD Falcon 353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 BD Clay Adams
10% sucrose Sigma S0389 Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) American Peptide Company  custom synthesized, 10mg/mL
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) American Peptide Company  custom synthesized, 7.5mg/mL
Complete medium RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5mM HEPES, 50uM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640  Gibco 11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum) Atlanta Biologicals S11150 Heat inactivated before use
Pen/Strep Gibco 15140-122
L-glutamine 200mM (100x) Gibco 25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100x Gibco 11140-050
1M HEPES BioWhittaker 17-737E
2-Mercaptoethanol (100X) Millipore ES-007-E
Platform shaker: The Belly Dancer Stovall Life Sciences Inc. model: USBDbo

References

  1. Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
  2. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  3. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  4. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  5. Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
  6. Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
  7. Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
  8. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
  9. Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
  10. Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
  11. Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
  12. Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
  13. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  14. Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
  15. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  16. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
  17. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
  18. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
  19. Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
  20. Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
  21. Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
  22. Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
  23. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
  24. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
  25. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).

Play Video

Cite This Article
Tajima, A., Liu, W., Pradhan, I., Bertera, S., Lakomy, R. A., Rudert, W. A., Trucco, M., Meng, W. S., Fan, Y. Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel. J. Vis. Exp. (112), e54062, doi:10.3791/54062 (2016).

View Video