Promoción de 3-D agregación de células epiteliales del timo FACS purificada con EAK 16-II / EAKIIH6 auto-montaje de hidrogel
Summary
This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.
Abstract
Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.
Introduction
El timo es el órgano linfoide primario responsable de la generación de una población diversa de células T a patógenos reactiva, la auto-tolerancia que es esencial para la función del sistema inmune adquirido. Es un órgano dinámico en el que los timocitos en desarrollo, emigraron de la médula ósea como células de linfocitos progenitoras, migran a través del tridimensional (3-D) de la matriz de tipo esponja del estroma tímico, someterse a linaje de especificación y diferenciación, y, finalmente emigrar como células T maduras. El éxito de este proceso bien programada depende en gran medida de la diafonía entre los timocitos que migran y las células epiteliales del timo residenciales (TEC), la población predominante del estroma tímico que son esenciales para el establecimiento y el mantenimiento de la integridad del microambiente del timo.
Sobre la base de su localización anatómica y la función única, TEC se puede dividir en dos subgrupos: los TECs en la corteza (CTEC) que son responsasable de la selección de auto-MHC (complejo principal de histocompatibilidad) limita las células T (selección positiva), y los TEC en la médula (mTECs) que son esenciales para la eliminación de las células T autorreactivas (selección negativa) 1,2. Muchos factores (por ejemplo, el envejecimiento, la infección, la irradiación, los tratamientos de drogas) pueden causar daños irreversibles en el epitelio tímico, dando como resultado la inmunidad adaptativa comprometida. A pesar de los numerosos intentos, la restauración de la función del timo ha sido difícil debido a la dificultad para reproducir el microambiente tímico. En particular, la configuración del timo tridimensional (3-D) es crítico para la supervivencia y la función de TECs, mientras que TECs cultivadas en un entorno de 2-D disminuir rápidamente la expresión de genes críticos para la timopoyesis 3,4.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) y su análogo histidinylated C-terminal EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) son de bajo peso molecular, oligopéptidos anfifílicas que son solubles a finales desionizadar, pero someterse a la gelificación para formar ß-fibrillas cuando se expone a una fuerza iónica superior a NaCl 20 mM (concentración normal de sal en el fluido corporal humano es 154 mM). Esta propiedad de respuesta del medio ambiente los hace versátiles bloques de construcción para formar estructuras 3D. La etiqueta de His en EAKII-H6 proporciona un mecanismo de acoplamiento, por el que los anti-Sus IgG / Fc de unión a proteína recombinante A / G (αH6: pA / G) complejos pueden servir como un adaptador para anclar fármacos de proteínas y otras biomoléculas ( por ejemplo, anticuerpos) en el compuesto de hidrogel 5-8.
Hemos demostrado previamente que las moléculas marcadas con fluorescencia IgG anclados en el hidrogel pueden ser retenidos en el lugar de la inyección durante un máximo de 13 días 9. Además, cuando los αH6: se añadieron adaptadores de pA / G anclados con anti-CD4 IgG al hidrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK), las células T CD4 + fueron capturados específicamente 10. Usando técnica similar, hemos demostrado recientemente que la 3-D agregación de TECs cOuld ser promovido en EAK hidrogel con complejos adaptadores que llevan anticuerpos anti-EpCAM-TEC específica (αH6: PA / G: αEpCAM). Cuando se trasplantan debajo de las cápsulas renales de ratones desnudos, los grupos TEC incrustados en hidrogel EAK pueden apoyar eficazmente el desarrollo de las células T funcionales in vivo 11,12.
Aquí ilustramos nuestro método para purificar rápida y eficazmente TEC con células activadas por fluorescencia (FACS) y generar agregados TEC 3-D con el sistema EAK hidrogel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mientras TEC son la población predominante del estroma del timo y desempeñan papeles esenciales para la estructura y función de las glándulas del timo, que representan sólo alrededor del 0,1-0,5% de la celularidad del timo total. También son células frágiles como se observan ocasionalmente altos porcentajes de muerte de las células después de la digestión de la colagenasa, es decir, el tratamiento para disociar TECs de la matriz extracelular (ECM). Su rareza (~ 200.000 por el timo del ratón) y la fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R21 AI113000 (WSM) y R01 AI123392 (YF).
Materials
| 1. TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1X PBS, 0.1% BSA, 2mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 mL RPMI-1640, 0.025 mg/mL Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/mL DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2cc U-100 Insulin syringe 28G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5mL Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100um Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Cell sorting | |||
| 5mL Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2uL per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10uL per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10uL per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. EAK gel assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5mL Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5mL microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10mg/mL | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5mg/mL | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5mM HEPES, 50uM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100X) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
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