Summary

Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal

Published: April 07, 2016
doi:

Summary

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Abstract

El objetivo de este protocolo es describir las alteraciones moleculares en las córneas diabéticos humanos y demostrar cómo pueden ser aliviados mediante terapia génica adenoviral en córneas cultivadas de órganos. La enfermedad de la córnea diabética es una complicación de la diabetes con anomalías frecuentes de los nervios corneales y la curación de heridas epiteliales. También hemos documentado la expresión alterada de manera significativa de varios marcadores de células madre epiteliales putativos en córneas humanas diabéticos. Para aliviar estos cambios, la terapia génica adenoviral se aplicó con éxito el uso de la regulación al alza de la expresión de proto-oncogén c-met y / o la regulación a la baja de la matriz metaloproteinasa-proteinasas 10 (MMP-10) y la catepsina F. Esta terapia acelerado la cicatrización de heridas en diabéticos córneas incluso cuando fue transducida sólo el compartimento de células madre del limbo. Los mejores resultados se obtuvieron con el tratamiento combinado. Para el trasplante posible paciente de las células madre normalizadas, un ejemplo se presenta también de la optimizatien la transducción de genes en cultivos enriquecidos con células madre utilizando potenciadores policatiónicos. Este enfoque puede ser útil no sólo para los genes seleccionados, sino también para los otros mediadores de la cicatrización de la herida corneal epitelial y la función de células madre.

Introduction

La enfermedad de la córnea diabética se debe principalmente en el epitelio degenerativa (queratopatía) y cambios nerviosas (neuropatía). A menudo se manifiesta por las alteraciones de la cicatrización de heridas del epitelio y la reducción de nervio corneal 1-4. Se estima que 60-70% diabéticos tienen diversos problemas corneales 1,3. Nuestros estudios han identificado varias proteínas marcadoras con expresión alterada en las córneas diabéticos humanos, incluida la regulación a la baja de los proto-oncogén (receptor del factor de crecimiento de hepatocitos) c-met y la regulación al alza de la metaloproteinasa de matriz 10 (MMP-10) y la catepsina F 5, 6. también hemos documentado de manera significativa disminución de la expresión de varios marcadores de células madre epiteliales putativos en las córneas diabéticos humanos.

En los estudios anteriores hemos desarrollado una terapia génica basada en adenoviral para normalizar los niveles de marcadores de la diabetes alterado utilizando el sistema de la córnea diabética humana de cultivo de órganos, que muestra lenta la cicatrización de heridas, diabéticocambios de marcador, y la reducción de la expresión de marcadores de células similares a las córneas ex vivo 7,8 tallo. Esta persistencia de los cambios parece ser debido a la existencia de memoria metabólica epigenética 9. Este sistema de cultivo era más utilizados para la terapia génica. Los objetivos para esta terapia se eligieron a partir de marcadores, ya sea con una expresión reducida en córneas diabéticos (c-met proto-oncogén), o aumento de la expresión (MMP-10 y la catepsina F).

La terapia adenoviral (AV) se utilizó en todo el córneas de órganos-cultivadas o sólo la corneoscleral compartimento limbal periférica. Este compartimiento alberga las células madre epiteliales que renuevan el epitelio corneal y participan activamente en la curación de heridas 4,10-15. Aquí, se proporcionan protocolos para el cultivo normal y diabética humana corneal de órganos, la cicatrización de heridas del epitelio, el aislamiento y la caracterización de los cultivos celulares limbal enriquecida de células madre, y células adenoviral y la transducción de la córnea. Nuestraresultados demuestran la factibilidad de este tratamiento para la normalización de la expresión del marcador y la cicatrización de heridas en diabéticos córneas para trasplante posible futuro. También sugieren que la terapia de combinación es la forma más eficaz para restaurar patrón marcador normal y la curación epitelial en la córnea diabética 16-18.

Protocol

Investigación de Enfermedades Intercambio Nacional (ISRND, Filadelfia, PA) suministra post mortem ojos humanos sanos y diabéticos con autorización y córneas. protocolo de recogida de tejido humano de ISRND es aprobado por el comité directivo y sujetos a los Institutos Nacionales de Salud de supervisión. Esta investigación se ha llevado a cabo bajo la Junta aprobó el Cedars-Sinai Medical Center de Revisión Institucional (IRB) de protocolo exentos EX-1055. Colaborador de los cirujanos de córnea, los Dres. E. Maguen e Y. Rabinowitz, …

Representative Results

Hemos demostrado previamente que en los cultivos de órganos de la córnea, las diferencias en la expresión de marcadores de la diabetes (por ejemplo, proteínas de la membrana basal y α3β1 integrina) y la cicatrización de heridas entre las córneas normales y diabéticos se conservan. Este sistema de cultivo se sometió a la terapia génica dirigida a la normalización de los niveles de marcadores de la diabetes alterado, c-Met, MMP-10, y catepsina F. <p class="jove_con…

Discussion

La córnea parece ser un tejido ideal para la terapia génica debido a su ubicación superficie en la que la entrega de genes, así como la evaluación de la eficacia y efectos secundarios, son fáciles. Sin embargo, una traducción clínica de este enfoque poderoso sigue siendo lento debido a la escasa información sobre las causas genéticas de las enfermedades de la córnea y los objetivos de terapia génica 24. Complicaciones diabéticas, incluyendo alteraciones de la córnea pueden ser en gran parte epig…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We gratefully acknowledge financial support by NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), CTSI grant UL 1RR033176 (AVL), and grants from the Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.

Materials

minimum essential medium Thermo Fisher Scientific 11095-080
Optisol-GS  Bausch & Lomb 50006-OPT
ABAM antibiotic-antimycotic mixture Thermo Fisher Scientific 15240062
calf skin collagen  Sigma-Aldrich  C9791
agar, tissue culture grade Sigma-Aldrich  A1296
n-heptanol Sigma-Aldrich  72954-5ML-F
O.C.T. compound  VWR International 25608-930
Dispase II  Roche Applied Science 4942078001
keratinocyte serum-free medium (KSFM)  Thermo Fisher Scientific 17005042
EpiLife medium with calcium Thermo Fisher Scientific MEPI500CA
N2 medium supplement, 100x Thermo Fisher Scientific 17502-048
B27 medium supplement, 50x Thermo Fisher Scientific 17504-044
human keratinocyte growth supplement, 100x Thermo Fisher Scientific S-001-5
trypsin 0.25% – EDTA 0.02% with phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
trypsin 0.25% with phenol red Thermo Fisher Scientific 15050065
soybean trypsin inhibitor  Sigma-Aldrich  T6414
fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140079
insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) Sigma-Aldrich  I3146-5ML
antibody to keratin 14 Santa Cruz Biotechnology sc-53253
antibody to keratin 15 Santa Cruz Biotechnology sc-47697
antibody to keratin 17 Santa Cruz Biotechnology SC-58726
antibody to ΔNp63α Santa Cruz Biotechnology sc-8609
antibody to PAX6 BioLegend PRB-278P-100
antibody to nidogen-1 R&D Systems MAB2570
antibody to integrin α3β1 EMD Millipore MAB1992
human fibronectin BD Biosciences 354008
human laminin Sigma-Aldrich  L4445
human type IV collagen Sigma-Aldrich  C6745-1ML
adenovirus expressing MMP-10 shRNA Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing cathepsin F shRNA Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing c-met OriGene (plasmid) SC323278
adenovirus expressing GFP KeraFAST FVQ002
sildenafil citrate, 25 mg Pfizer from pharmacy
epidermal growth factor  Thermo Fisher Scientific PHG0311
poly-L-lysine Sigma-Aldrich  P4707
polybrene Sigma-Aldrich  107689-10G
ViraDuctin Cell Biolabs AD-200
ibiBoost ibidi, Germany 50301
phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049
Corning round end spatula  Dow Corning 3005
60-mm petri dishes Thermo Fisher Scientific 174888
Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides  Sigma-Aldrich C6807
200 microliter pipet tips Bioexpress P-1233-200 other suppliers available
inverted microscope  Nikon Diaphot other suppliers/models available
humidified CO2 incubator  Thermo Fisher Scientific 370 (Steri-Cycle) other suppliers/models available
fluorescent microscope Olympus, Japan BX-40 other suppliers/models available
dissecting stereo microscope Leica, Germany S4 E other suppliers/models available

References

  1. Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
  2. Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
  3. Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R. Corneal changes in diabetes mellitus. DOS Times. 20 (5), 55-58 (2015).
  4. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Prog Retin Eye Res. 49, 17-45 (2015).
  5. Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
  6. Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
  7. Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
  8. Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
  9. Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
  10. Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
  11. Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Exp Biol Med. 226 (7), 653-664 (2001).
  12. Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
  13. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
  14. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
  15. Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
  16. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  17. Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
  18. Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
  19. Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
  20. Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
  21. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  22. Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
  23. Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425 (2013).
  24. Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
  25. Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
  28. Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
  29. Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
  30. Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  31. Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
  32. Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
  33. Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
  34. Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).

Play Video

Cite This Article
Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (110), e54058, doi:10.3791/54058 (2016).

View Video