An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.
このプロトコルの目的は、ヒトの糖尿病角膜内の分子変化を説明し、それらが器官培養角膜にアデノウイルス遺伝子治療によって軽減することができる方法を示すことです。糖尿病性角膜疾患は、角膜神経と上皮創傷治癒の頻繁な異常を伴う糖尿病の合併症です。我々はまた、ヒトの糖尿病角膜内のいくつかの推定上皮幹細胞マーカーの有意な発現変化を報告しています。これらの変化を緩和するために、アデノウイルス遺伝子治療は、正常のc-Met癌原遺伝子発現のアップレギュレーションおよび/またはプロテイナーゼマトリックスメタロプロテイナーゼ10(MMP-10)およびカテプシンF.この治療のダウンレギュレーションを用いて実施されたが、糖尿病性角膜において創傷治癒を加速します唯一の輪部幹細胞区画を形質導入した場合であっても。最良の結果は、併用治療で得られました。正規化された幹細胞の可能性のある患者の移植のために、例もoptimizatiで提示されていますポリカチオン性増強剤を使用して幹細胞に富む培養物における遺伝子導入の上。このアプローチでは、選択された遺伝子についても、角膜上皮の創傷治癒の他のメディエーターのためだけでなく、有用であると細胞機能幹よいです。
糖尿病性角膜疾患は、主に退行性上皮(角膜症)と神経(神経障害)の変化をもたらします。それは多くの場合、上皮創傷治癒および角膜神経削減1-4の異常によって明らかにされています。推定60から70パーセントの糖尿病患者は1,3、様々な角膜の問題を抱えています。我々の研究は、変化したのc-Metプロトオンコジーン(肝細胞増殖因子受容体)のダウンレギュレーションを含む、ヒトの糖尿病角膜における発現およびマトリックスメタロプロテイナーゼ10(MMP-10)およびカテプシンF 5,6の上方制御で複数のマーカータンパク質を同定しました。我々はまた、大幅に文書化されたヒトの糖尿病角膜にいくつかの推定上皮幹細胞マーカーの発現が低下しています。
以前の研究では、糖尿病、遅い創傷治癒を示し、ヒト糖尿病性角膜器官培養系を用いた糖尿病改変マーカーのレベルを正常化するために、アデノウイルスに基づく遺伝子治療を開発しましたマーカーの変更、およびex vivo角膜7,8と同様の細胞マーカー発現の減少を食い止めます。この変更の持続性は、エピジェネティックな代謝メモリ9の存在によるものと思われます。この培養系は、さらに、遺伝子治療のために使用しました。この治療のためのターゲットは、糖尿病性角膜における発現低下( のc-Met癌原遺伝子)、または増加した発現(MMP-10およびカテプシンF)のいずれかでマーカーから選択されました。
アデノウイルス(AV)療法は、全器官培養角膜または唯一の強角膜周辺輪部の区画に使用しました。この区画は、角膜上皮を更新し、積極的に4,10-15創傷治癒に関与する上皮幹細胞を保有します。ここでは、プロトコルが正常及び糖尿病のヒト角膜臓器培養、上皮創傷治癒、幹細胞に富む輪部細胞培養物の単離および特徴付け、ならびにアデノウイルス、細胞および角膜形質導入するために提供されます。私たちの結果は、将来の移植のための糖尿病性角膜にマーカー発現および創傷治癒を正規化するため、この治療法の実現可能性を示しています。彼らはまた、併用療法は、糖尿病性角膜16-18通常マーカパターンと上皮の治癒を回復するための最も効果的な方法であることを示唆しています。
角膜が原因遺伝子送達、ならびに有効性および副作用の評価は、簡単で、その表面の場所に遺伝子治療のための理想的な組織であると思われます。しかし、この強力なアプローチの臨床翻訳はまだによる角膜疾患や遺伝子治療のターゲット24の遺伝的原因に乏しい情報に遅いです。角膜の変化を含む糖尿病の合併症は、代謝メモリ9に変換され、自然の中で主にエピジェネティ…
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge financial support by NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), CTSI grant UL 1RR033176 (AVL), and grants from the Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.
minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
trypsin 0.25% – EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
60-mm petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
200 microliter pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |