رصد بصري الأعصاب الطرفية المعيشة وصفها في الشعر المسام سناني الشكل النهايات لل<em> فيفو السابقين</em> ماوس الأذن الجلد
Summary
Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.
Abstract
ووصف تشريح والتسجيل تقنية جديدة لتلطيخ الرصد البصري واجتثاث تلطيخ محطات سناني الشكل المحيطة بصيلات الشعر في الجلد من الصيوان الماوس. إعداد بسيط وسريع نسبيا، مما أسفر موثوق مناطق واسعة من وحدات المسمى متعددة من الذين يعيشون النهايات العصبية لدراسة امتصاص وإطلاق الأصباغ البيريدينيوم styryl تستخدم على نطاق واسع في الدراسات لإعادة تدوير حويصلة. تقسيم الاستعدادات قبل وضع العلامات يسمح اختبار مقابل مقارنات تحكم في نفس الأذن من فرد واحد. يتم إعطاء نصائح مفيدة لتحسين نوعية إعداد ووضع العلامات والمعلمات التصوير. هذا النظام الجديد هو مناسب لمعايرة دواء وامتصاص وإطلاق هذه الأصباغ الحيوية في محطات سناني الشكل في كل من النوع البري والحيوانات المعدلة وراثيا ميكانيكيا التي يسببها. وثمة أمثلة عن التأثيرات تغييري على وضع العلامات كثافة.
Introduction
النهايات العصبية ميكانيكية حسية وعادة ما تكون صغيرة، وزعت منتشرة ويصعب الوصول إليها في الموقع، وعادة ما يتم دفنها عميقا في الجلد أو الأنسجة المحيطة بها. تصور لهم، ولذلك عادة ما يتطلب باجتزاء تليها immunolabeling لفترة طويلة / فترة تلطيخ، أو التأخير وتكاليف الحصول على خطوط الفأر مع التعبير الجيني للتسميات فلوري مثل البروتين الفلوري الأخضر أو الأصفر (GFP / YFP) 1. نحن هنا تظهر الأنسجة مريحة وطريقة سريعة وبسيطة للوصول إلى أعداد كبيرة من afferents بصيلات الشعر للدراسة، وكيف يمكن أن توصف بسرعة للرصد البصري وظيفة محطة 2. مع الممارسة، ويمكن الانتهاء من تقنية كاملة من تشريح التصوير في اقل من 2 ساعة.
محطات سناني الشكل من المحاور الحسية التعصيب بصيلات الشعر في الثدييات تشكل الحواجز حول ظهارة الشعر المسام، مع كلمحطة تقع بين الدبقية خلية / شوان العمليات 2-4. والغرض من هذه المحطات هو الكشف عن تشريد الميكانيكية من الشعر يحيطون. هم خليط من النهايات التكيف بسرعة وببطء، ولكنها تنتج في الغالب رشقات نارية قصيرة من النشاط في الاستجابة لحركة الشعر. عادة، يتوقف اطلاق النار بسرعة كبيرة عندما تتوقف الحركة، حتى في وجود استمر النزوح.
هذا النموذج الصيوان الفئران لدراسة محطات سناني الشكل طريق وسائل بصرية لديها العديد من الميزات مفيدة لدراسة بنية ووظيفة هذه النهايات. الصيوان هو في الغالب طبقتين من الجلد الرئيسي يعارضها-العودة إلى الوراء، مع كمية صغيرة فقط من نسيج الغضروف بين. الجلد رقيقة جدا وتشريح بسهولة نظرا لكميات ضئيلة من النسيج الضام لاصقة ضعيفة بالنسبة إلى مناطق أخرى من الجسم. طبقات الجلد فصلها بسهولة، وبالتالي، تعطي سهولة الوصول إلى بصيلات والمحطات. تعصيبيمكن الوصول إليها بسهولة والتعرف. يتم توزيع بصيلات الشعر أكثر قليلة منه في مناطق الجلد الأخرى، وتسهيل التصوير من الأفراد أو الجماعات الصغيرة من المسام. طبقة الجلد الأساسية رقيقة يعطي الوصول جيدة لالأصباغ والأدوية الصيدلانية، وذلك هو المثل الأعلى للتصوير بواسطة المجهر مضان دون مزيد من المعالجة. التصوير من محطات المسمى إما أن تكون محطات الذين يعيشون أو، في حالة استخدام التناظرية صبغ قابل للتثبيت، بعد تثبيت ومزيد من المعالجة النسيجي.
وقد استخدمنا هذا التحضير لإظهار أن الغشاء يحدث إعادة التدوير في النهايات سناني الشكل، يتضح من امتصاص (الإلتقام) وإطلاق (إيماس) من صبغة styryl البيريدينيوم (FM1-43؛ ن – (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) البيريدينيوم ثنائي البروميد). الصبغة لا، ومع ذلك، يبدو أن تسمية بشكل كبير خلايا شوان الاستثمار العمليات 2. أظهرنا أيضا أن هذه الصبغة امتصاص / الإفراج عنهم، وبالتالي غشاء صecycling، يخضع للتعديل glutamatergic من خلال شاذة (فسفوليباز يقترن D) metabotropic مستقبلات الغلوتامات. ويوضح نتائج التحفيز وتحليل بروتوكولات بسيطة، وتسليط الضوء على قضايا تحليل المحتملة المشتركة أيضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bewick وبيتز وضعت أصلا لN- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) البيريدينيوم ثنائي البروميد ذات الصلة الأصباغ styryl البيريدينيوم 7-10 لمراقبة إعادة التدوير المحلي للغشاء الحويصلة متشابك. صبغ امتصاص، وبالتالي زيادة مضان، وبالتالي يعكس متشابك استيعاب غشاء الحويصلة (الإلتقام). وفي وقت لاحق، وهذا صبغ المنضوية يمكن إعادة إصدارها من قبل المزيد من النشاط الكهربائي، والتي تبين فقدان الصبغة تراقب تخريج غشاء الحويصلة (إيماس). في نقاط الاشتباك العصبي، وهذا هو وكيل لإفراز الناقل العصبي. في نفس الوقت، كما وجدنا هذه الأصباغ علامة مميزة النهايات العصبية ميكانيكية حسية الابتدائية 7. وفي الآونة الأخيرة 11، Bewick، البنوك وزملاؤه ثم أظهر أن هذا يعكس عملية مماثلة في ناضجة، والمحطات ميكانيكية حسية متباينة خارج الحي. هنا مرة أخرى، والأصباغ بوسم 50 نانومتر قطر الحويصلات "مثل متشابك" (يتعامل هؤلاء الموردون) أن إعادة تدوير جوهري للافراج عن الغلوتامات.في محطات ميكانيكية حسية، على عكس نظرائهم متشابك، وهذا التدوير هو عفوية في المقام الأول. والتضمين أيضا من قبل الميكانيكية، بدلا من مجرد الكهربائي، التحفيز.
لالخلايا العصبية الحسية في الثقافة وفي خلايا الشعر القوقعة، والأصباغ styryl بشكل عام وstyryl صبغ البيريدينيوم على وجه الخصوص وقد ثبت أن تمر عبر قنوات ميكانيكية حسية، ومنع القنوات ميكانيكية حسية وصفها بشكل لا رجعة فيه الأغشية الداخلية 12. ومع ذلك، في تركيزات styryl صبغ مماثلة في محطات ميكانيكية حسية متباينة في الموقع، وهنا في النهايات سناني الشكل 2، أو في نهايات الأول (أ) في مغزل العضلات 11، وفي خلايا الشعر التي لا يتم تحفيز ميكانيكيا 13 و 14 و وضع العلامات من قبل الإلتقام الغشاء. في النهايات العصبية ميكانيكية حسية، على سبيل المثال، وضع العلامات هو عكسها ولا يمنع الردود ميكانيكية حسية في التراكيز المستخدمة هنا 2، 11، 15. وفي حين أن بعض استيعاب صبغ من قبل تخلل قناة في هذه النهايات لا يمكن استبعاده تماما، ويزيل اللون شبه الكامل مع latrotoxin يشير إلى أن الغالبية العظمى من وضع العلامات في محطات الناضجة هي عن طريق استيعاب مع غشاء الحويصلة إعادة التدوير. لقد وبالتالي، وتستخدم هذه التقنية لدراسة اعتماد النشاط 11، ومؤخرا، والصيدلة 2 من إعادة التدوير السلفادور في المحطات وارد ميكانيكية حسية من خلال دراسة آثار المخدرات على امتصاص وإطلاق الأصباغ.
كما هو الحال مع معظم التقنيات العملية، واستنساخ يتطلب التكرار والممارسة. سيتم الآن مناقشة بعض النقاط الرئيسية لضمان موثوقية. وضع العلامات سناني الشكل في الحيوانات الأصغر سنا هو أكثر موثوقية – وكان أصغر حيوان استخدمنا 15 غرام من وزن الجسم. وليس من الواضح تماما لماذا هذا هو الحال، ولكن قد يكون ذلك بسبب تشريح النسيج الضام الشابة يتطلب أقل الصدمات الميكانيكية ولوأفيس أقل المتبقية بقايا عند إزالة الأنسجة التي تغمر طبقة تعصيب.
وعموما، فإن إعداد الأنسجة بسيط للغاية، مع تقشير طبقات الجلد عدا كونها الجانب العملي الأكثر تحديا تقنيا وبعد ذلك فقط في الفئران الأكبر سنا. في هذه، وطبقات الجلد تلتزم بقوة معا في القاعدة حيث يبدأ تشريح، ولكن حتى هنا الفصل بين طبقات يصبح أسهل بكثير نحو الهوامش. لحسن الحظ، أو ربما نتيجة لذلك، هذه مناطق الجلد هامشية أرق وعادة ما تعطي وصفها مرضية للغاية، وكذلك الجلد الأمامي بشكل عام. لذلك، لا سيما تجنب استيعاب الجلد رقيقة جدا في الهوامش. للحد من خطر تلف، والتعامل معها التحضيرات بشكل غير مباشر عن طريق دفع مع ملقط مغلقة بدلا من استيعاب مباشرة، أو إذا فهم أساسي الأنسجة فقط أكثر صرامة من غير المرجح أن يكون المسمى. كن دقيقا في إزالة طبقة "ورقة البوليسترين" المغطي على الفور المسام، وهذا هو لي الرئيسيانسداد chanical التصوير وصول المخدرات. ومع ذلك، فمن الضروري تقليل الاتصال الجسدي مع الهياكل الأساسية مثل هذا الضرر (أي تجرد بعيدا) والشبكات العصبية ومحطات أقل بقليل. إذا مضان السائد هو أصفر / أبيض في الغدد الدهنية، وبارز لصناعة السيارات في مضان من قواعد عمود الشعر وبعض أهلة برتقالي / أصفر النهايات سناني الشكل، وهذا يشير تم إزالة طبقة الضفيرة العصبية ومحطات سناني الشكل المقترنة أثناء إزالة. هذا ويبدو أن المشكلة الرئيسية مع كبار السن (> 30 ز) الفئران. من خلال كافة الإجراءات تلطيخ، وضمان كل شيء عند 30 درجة مئوية والاوكسيجين بشكل جيد. كن على علم بأن المحطات وصفت لا تزال على قيد الحياة. ونتيجة لذلك، سوف تفرز الصبغة التي كتبها عفوية (التأسيسي) الإفراج exocytic مستمر. هذا وسوف يكون أبطأ في R / T، وإنما هو ممارسة جيدة للحد من التأخير بين إزالة حل خالب والتصوير، للحد من فقدان الصبغة. وعلاوة على ذلك، لمدة تتراوح بين الجماعات الصورة المقارنةtudies من شدة، فمن الضروري لضمان تمثيل جميع الفئات غير المطابقة للوقت. استخدام عامل صباغة مخلبية قبل التصوير يحسن إلى حد كبير على النقيض من الصورة. لذلك، في حين أن تكلفة نسبيا، فإن الخطوة عملية إزالة معدن ثقيل مهمة جدا لضمان جودة الصورة جيدة. استخدام خالب يمكن التقليل عن طريق إعادة استخدام الحل عدة مرات، وحتى على 2-3 أيام متتالية، إذا المخزنة في 4 درجات مئوية بين الاستخدامات. تجاهل الحل خالب بمجرد أن يذهب بشكل ملحوظ وردي، والتي تبين عزل صبغ بها تقترب من مستويات التشبع.
أثناء التصوير، ويكون على بينة من احتمال حدوث ضرر الضوئي السمي لهذه المحطات الحية، وهي نتيجة تراكمية لكل من شدة ومدة التعرض للضوء الإثارة. وهذا الاعتبار هو أقل أهمية للصور timepoint واحد، حيث جودة الصورة هي الشغل الشاغل. ومع ذلك، فإنه من الأهمية بمكان أثناء التصوير تتكرر في دراسات حركية للحد من التعرض للضوء الإثارة إلى أدنى حد ممكن. في حين أن تطوير هذه الأصباغ لنقاط الاشتباك العصبي التسمية، وجدنا الإثارة ل> 1 دقيقة في السلطة الكاملة الإثارة الإضاءة سوف يتسبب في ضرر لا يمكن إصلاحه مثيرة وإلى النهايات العصبية. لأول مرة في وقت لاحق توسيع بشكل كبير، ثم تنهار تماما على مدى فترة من ~ 15 دقيقة. نحن لم يختبر بشكل منهجي المساهمات النسبية من وقت التعرض وشدته، ولكن هذه الملاحظات تشير إلى أن المبدأ التوجيهي يجب أن يكون للحد من كليهما. لذلك، فمن المستحسن أن ضوء الإثارة كثافة ومدة هي الحد الأدنى يتناسب مع الحصول على صور جيدة، وتؤخذ الصور الرقابة المناسبة في الدراسات قتا بالطبع. لاختبار أن البيانات لا تتأثر الضيائية في ظل ظروف التصوير المتكررة، في كل نقطة زمنية التقاط صورة إضافية من محطة unviewed سابقا. هذا هو التأكد من سلوك وصفها في محطات ساذجة يشبه في بصيلات يجري تصويره مرارا وتكرارا.
هناك عدد من العوامل يمكن أن تقلل من التباين داخل المجموعة من صافي كثافة دآتا. وضع دقيق للرويس، ولا سيما العائد على الاستثمار الخلفية، مهم، حتى مناطق صغيرة من تلطيخ غير مناسب يمكن أن تؤثر بشكل كبير بين-جراب تقلب البيانات. ويتأثر التغير في صافي كثافة أيضا كيف تماما المحاصرة كل بصيلات الشعر من جرف النهايات. مقارنة على سبيل المثال، على شكل هلال توزيع العلامات في الشكل 1B مع نمط تقريبا دائري تماما هو مبين في الشكل 2. المزيد تحليل مركب، ربما باستخدام برامج الكشف الآلي والعتبة والتي تكون ضرورية إذا كانت درجة تطويق معلمة ذات الصلة. يرجى ملاحظة أن توزع الكثافة حتى لجماعات بصيلات معظم تحليلها بدقة ليست موزعة بشكل طبيعي (انظر الشكل 3)، مما استلزم استخدام الإحصاءات غير المعلمية للمقارنات بين معاملة الوساطات السكان بدلا من الوسائل. تقنيات التطبيع، مثل التعبير عن شدة كنسبة مئوية من سيتم فرض رقابة F المقابل، أو وجود مجموعة مراقبة تتكون من عدة الاستعدادات، ويمكن تطبيقها للحد من زيادة التقلبات. البند الفني النهائي للنظر هو التصميم التجريبي لاختبار الدوائية. وخلال التحقيقات الدوائية، قبل احتضان إعداد في حل المخدرات لمدة 30 دقيقة قبل تطبيق الصبغة. ثم، والحفاظ على تركيز الدواء في محلول الصبغة. في الضوابط، استخدم إما مالحة أو، إذا تم حل المخدرات في سيارة، والمياه المالحة بالإضافة إلى السيارة.
توضح هذه المادة كيف يقدم هذا المستحضر الصيوان جديد صور عالية الجودة من النهايات ميكانيكية حسية في الجلد مع الحد الأدنى من الإعداد. وتبين لنا أيضا أنها يمكن أن تستخدم لدراسة الصيدلة من عنصرين هامين لإعادة تدوير حويصلة. وتبين لنا أولا أن ناهض مستقبلات الغلوتامات يمكن أن تزيد استيعاب صبغ (علامة من الإلتقام)، والثانية، يتم فقدان الصبغة من جديد مع latrotoxin (منبه من إيماس). وتكمن أهمية هذا preparatأيون والتقنية هو أنه يوفر سهولة الوصول إلى الذين يعيشون الجلد محطات mechanosenory في الموقع لتجارب التصوير، وتكفل فرصا فريدة لرصد بصري وظيفة الطرفية والهيكل وعلاقتها ببعضها. تحقيقا لهذه الغاية الأخيرة، وقد وضعنا أيضا أكثر من ذلك لاستخدامها في دراسات مشتركة البصرية / الكهربية (انظر شقيقة المادة إن الرب لمزيد من التفاصيل).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة منحة المشروع G0601253 إلى GSB ومراسلون بلا حدود ومنحة SULSA Bioskape إلى GSB
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
