Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del<em> Ex Vivo</em> Mouse Ear pelle
Summary
Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.
Abstract
Una tecnica dissezione e la registrazione romanzo è descritto per ottica colorazione monitoraggio e de-colorazione dei terminali lanceolate circonda i follicoli piliferi nella pelle della pinna mouse. La preparazione è semplice e relativamente veloce, ottenendo in modo affidabile vaste regioni della più unità etichettati di terminazioni nervose viventi per studiare l'assorbimento e il rilascio di stirilici coloranti piridinio ampiamente utilizzati negli studi di riciclo delle vescicole. Suddividendo i preparativi prima di etichettatura permette di prova vs. confronti di controllo nello stesso orecchio da un singolo individuo. consigli utili sono dati per migliorare la qualità della preparazione, l'etichettatura ei parametri di imaging. Questo nuovo sistema è adatto per saggiare farmacologicamente e l'assorbimento e il rilascio di questi coloranti vitali nel terminal lanceolate sia wild-type e animali geneticamente modificati meccanicamente indotte. Esempi di influenze modulatori sulla intensità di etichettatura sono dati.
Introduction
Terminazioni nervose meccanosensoriali sono tipicamente piccole, diffusamente distribuita e di difficile accesso in situ, in quanto sono di solito sepolti in profondità nella pelle o altri tessuti circostanti. Loro visualizzazione, di conseguenza, di solito richiede sezionamento seguito da un prolungato immunomarcatura / periodo di colorazione, o il ritardo e la spesa di ottenere linee del mouse con l'espressione genetica di etichette fluorescenti come la proteina fluorescente verde o giallo (GFP / YFP) 1. Qui vi mostriamo un tessuto comodo e un metodo rapido e semplice per ottenere l'accesso a un gran numero di afferenti follicolo pilifero per lo studio, e come possono essere rapidamente etichettato per il controllo ottico della funzione del terminale 2. Con la pratica, l'intera tecnica da dissezione all'imaging può essere completato in meno di 2 ore.
I terminali lanceolate di assoni sensitivi che innervano i follicoli piliferi nei mammiferi formano palizzate intorno l'epitelio dei capelli-follicolo, con ogniterminale inserita tra gliali cellule / Schwann processi di 2-4. Lo scopo dei morsetti è per rivelare lo spostamento meccanico dei peli che circondano. Essi sono una miscela di terminazioni rapidamente e lentamente adattando, ma prevalentemente producono brevi sequenze di attività in risposta al movimento dei capelli. Tipicamente, la cottura ferma molto rapidamente quando il movimento cessa, anche in presenza di spostamento continuato.
Questo modello murino pinna per lo studio di terminali lanceolate con metodi ottici ha molte caratteristiche vantaggiose per studiare la struttura e la funzione di queste terminazioni. La pinna è prevalentemente due strati di pelle apposto back-to-back, con solo una piccola quantità di tessuto cartilagine tra. La pelle è molto sottile e facilmente sezionato causa di minime quantità di adesivo debolmente tessuto connettivo rispetto ad altre regioni del corpo. Gli strati di pelle facilmente separati, quindi, dare un buon accesso ai follicoli e terminali. l'innervazioneè facilmente accessibile e identificabile. I follicoli dei capelli sono più scarsamente distribuiti che in altre regioni della pelle, facilitando la formazione immagine di individui o piccoli gruppi di follicoli. Lo strato dermico sottostante sottile dà una buona accessibilità ai coloranti e droghe farmacologiche, quindi è l'ideale per l'imaging mediante microscopia a fluorescenza, senza ulteriori elaborazioni. La formazione immagine di terminali marcati può essere sia di terminali viventi o, se si utilizza un analogo tintura risolvibile, dopo la fissazione e il successivo trattamento istologico.
Abbiamo usato questa preparazione per dimostrare che la membrana di riciclaggio si verifica nelle terminazioni lanceolate, dimostra assorbimento (endocitosi) e il rilascio (esocitosi) di un colorante styryl piridinio (FM1-43; N – (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) piridinio dibromuro). Il colorante non, tuttavia, sembra etichettare in modo significativo i processi della cellula di Schwann investire 2. Abbiamo anche dimostrato che questo colorante assorbimento / rilascio, e quindi membrana reCycling, è soggetto alla modulazione glutamatergica attraverso un atipico (fosfolipasi D-coupled) dei recettori metabotropici del glutammato. I risultati di semplici protocolli di stimolazione e di analisi sono illustrati, e potenziali problemi di analisi comuni sono state evidenziate anche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bewick e Betz originariamente sviluppato la N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) piridinio dibromuro-correlato coloranti styryl piridinio 7-10 per monitorare il riciclaggio locale della membrana delle vescicole sinaptiche. Dye assorbimento, e quindi un aumento della fluorescenza, riflette quindi sinaptica internalizzazione membrana delle vescicole (endocitosi). Successivamente, questo colorante interiorizzato può essere ripubblicato da ulteriori attività elettrica, mostrando la perdita di colorante monitora esternalizzazione membrana delle vescicole (esocitosi). In sinapsi, questo è un proxy per la secrezione di neurotrasmettitori. Allo stesso tempo, abbiamo anche trovato questi coloranti etichetta primarie terminazioni nervose meccanosensoriali 7. Più di recente 11, Bewick, Banche e colleghi hanno poi dimostrato che questo riflette un processo simile a maturi, terminali meccanosensoriali differenziate ex vivo. Anche in questo caso, i coloranti etichetta 50 di diametro vescicole sinaptiche nm 'simile' (SLV) che riciclano costitutivamente al rilascio di glutammato.In terminali meccanosensoriali, a differenza dei loro omologhi sinaptiche, questo riciclaggio è soprattutto spontanea. Inoltre è modulata da meccanico, piuttosto che semplicemente elettrico, stimolazione.
Per i neuroni sensoriali nella cultura e nelle cellule ciliate coclea, stirilici in generale e styryl colorante piridinio in particolare hanno dimostrato di passare attraverso i canali meccanosensoriali, bloccando i canali meccanosensoriali ed etichettatura irreversibilmente membrane interne 12. Tuttavia, a concentrazioni di colorante styryl paragonabili a terminali meccanosensoriali differenziati in situ, come qui in terminazioni lanceolate 2, o di terminazioni Ia in 11 fusi muscolari, e in cellule ciliate che non vengono stimolati meccanicamente 13, 14, l'etichettatura è per endocitosi membrana. In terminazioni nervose meccanosensoriali, per esempio, l'etichettatura è reversibile e non blocca le risposte meccanosensoriali alle concentrazioni utilizzate qui 2, 11, 15. Mentre alcuni colorante interiorizzazione da permeazione canale in queste terminazioni non può essere completamente escluso, il Decolorare quasi totale con latrotoxin indica la grande maggioranza della etichettatura di terminali maturi è di internalizzazione con membrana riciclo delle vescicole. Abbiamo, quindi, utilizzato questa tecnica per studiare la dipendenza di attività 11 e, più recentemente, la farmacologia 2 del riciclaggio SLV nei terminali afferenti meccanosensoriali esaminando gli effetti dei farmaci sulla assorbimento e il rilascio dei coloranti.
Come con la maggior parte delle tecniche pratiche, riproducibilità richiede la ripetizione e la pratica. Alcuni dei punti chiave per assicurare l'affidabilità sarà ora discusso. etichettatura Lanceolate negli animali giovani è più affidabile – l'animale più piccolo abbiamo usato era 15 g di peso corporeo. Non è del tutto chiaro perché questo è il caso, ma può essere causa dissezione del tessuto connettivo minore richiede meno traumi meccanici e leaves meno restante residuo quando si rimuovono i tessuti sovrastanti lo strato di innervazione.
Nel complesso, la preparazione dei tessuti è abbastanza semplice, con peeling gli strati di pelle a parte essendo l'aspetto pratico tecnicamente più impegnativo e quindi solo nei topi anziani. In questi, gli strati di pelle aderiscono fortemente insieme alla base dove inizia la dissezione, ma anche qui la separazione degli strati diventa molto più facile verso i margini. Per fortuna, o forse di conseguenza, queste aree cutanee più sottili marginali di solito danno l'etichettatura più soddisfacente, così come la pelle anteriori in generale. Pertanto, in particolare evitando afferrando la pelle molto sottile ai margini. Per ridurre al minimo il rischio di danni, manipolare preparati indirettamente spingendo con una pinza chiusa piuttosto che cogliere direttamente, oppure se cogliere essenziale tessuti solo più severe improbabile che sia etichettato. Essere approfondita nel rimuovere lo strato 'foglia di polistirene' immediatamente sovrastante i follicoli, in quanto questo è il principale meostruzione meccanico di imaging e l'accesso di droga. Tuttavia, è essenziale per ridurre al minimo il contatto fisico con le strutture sottostanti come questo danno (ad esempio, le strisce di distanza) le reti neurali e terminali appena sotto. Se la fluorescenza predominante è il giallo / bianco nelle ghiandole sebacee, prominente auto-fluorescenza delle basi degli alberi dei capelli e pochi mezzelune di colore arancione / giallo terminazioni lanceolate, questo indica il livello dei nervi del plesso e terminali lanceolate associati sono stati rimossi durante il gioco. Questo sembra essere il problema principale con anziani (> 30 g) topi. Nel corso delle procedure di colorazione, assicurano tutto è a 30 ° C e ben ossigenate. Essere consapevoli del fatto che i terminali marcati sono ancora vivi. Di conseguenza, tintura sarà secreto dal corso spontanea (costitutiva) di rilascio esocitica. Questo sarà più lento a R / T, ma è buona norma ridurre al minimo il ritardo tra la rimozione della soluzione chelante e di imaging, per minimizzare la perdita di colorante. Inoltre, tra il-gruppi s comparativiTUDI di intensità, è essenziale garantire immagini di tutti i gruppi è tempo-abbinato. Uso di un agente colorante chelante prima di imaging migliora notevolmente contrasto dell'immagine. Così, mentre relativamente costoso, il passo chelazione è molto importante per garantire una buona qualità dell'immagine. uso chelante può essere minimizzata riutilizzare la soluzione più volte, e anche sul 2 – 3 giorni consecutivi, se conservati a 4 ° C tra usi. Scartare la soluzione chelante una volta che va notevolmente rosa, mostrando il suo sequestro colorante si avvicina alla saturazione.
Durante l'imaging, essere consapevoli del rischio di danni fototossica per questi terminali viventi, che è un risultato cumulativo sia l'intensità e il tempo di esposizione della luce di eccitazione. Questa considerazione è meno importante per le immagini singolo timepoint, in cui la qualità delle immagini è la preoccupazione principale. Tuttavia, è fondamentale durante l'imaging ripetuti in studi cinetica per ridurre l'esposizione luce di eccitazione al minimo. Durante lo sviluppo di questi coloranti asinapsi etichetta, abbiamo trovato di eccitazione per> 1 min a eccitazione illuminazione piena potenza causerà un danno drammatico e irreparabile per terminazioni nervose. In primo luogo successivamente espandono enormemente, poi collassano completamente in un periodo di ~ 15 min. Non abbiamo provato sistematicamente i contributi relativi del tempo di esposizione e intensità, ma queste osservazioni suggeriscono il principio guida dovrebbe essere quello di ridurre al minimo sia. Quindi, si raccomanda che l'intensità della luce di eccitazione e durata sono il minimo commisurato con ottenere buone immagini, e le immagini di controllo appropriati sono prese in studi time corso. Per verificare che i dati non sono interessati da fototossicità in condizioni di imaging ripetuti, in ogni punto prendere un'immagine aggiuntiva di un terminale in precedenza non visualizzato. Questo è quello di garantire il comportamento del etichettatura terminali ingenui assomiglia a quella nei follicoli di essere ripreso più volte.
Una serie di fattori in grado di ridurre la variabilità intra-gruppo di intensità in quotaata. posizionamento accurato delle ROI, in particolare il fondo ROI, è importante, in quanto anche piccole aree di colorazione inadeguato possono influenzare notevolmente tra-follicolo variabilità dei dati. La variabilità di intensità netta è influenzata anche dal modo completamente ogni follicolo pilifero è circondato da la palizzata di terminazioni. Confronto per esempio, la forma di mezzaluna distribuzione etichettatura in Figura 1B con il pattern quasi completamente circolare visibile in figura 2. Ulteriori analisi complessa, magari utilizzando software di rilevamento automatico e thresholding, sono necessari se il grado di accerchiamento è un parametro rilevante. Si prega di notare che le distribuzioni di intensità anche per i gruppi follicolo più accuratamente analizzati non sono distribuiti normalmente (si veda la Figura 3), che richiede l'uso di statistiche non parametrici per i confronti tra il trattamento di mediane di popolazione piuttosto che mezzi. tecniche di normalizzazione, per esempio esprimere intensità come percentuale of comando controlaterale, o di un gruppo di controllo costituito da diversi preparati, può essere applicato per ridurre ulteriormente la variabilità. La voce tecnica finale da considerare è il disegno sperimentale per il test farmacologici. Durante prove farmacologiche, pre-incubare il preparato in soluzione medicinale per 30 minuti prima dell'applicazione tintura. Quindi, mantenere la concentrazione del farmaco nella soluzione colorante. In controlli, utilizzare soluzione fisiologica o, se il farmaco viene sciolto in un veicolo, salina più veicoli.
Il presente articolo viene illustrato come questa nuova preparazione Pinna offre immagini di alta qualità di terminazioni meccanosensoriali in pelle con una minima preparazione. Mostriamo anche esso può essere utilizzato per esaminare la farmacologia dei due aspetti critici di riciclo delle vescicole. Mostriamo prima che un agonista del recettore del glutammato può aumentare colorante interiorizzazione (un marcatore di endocitosi), e in secondo luogo, che il colorante è perso di nuovo con latrotoxin (uno stimolante di esocitosi). Il significato di questo preparatione e la tecnica è che offre un ottimo accesso alla pelle terminali mechanosenory vivere in situ per gli esperimenti di imaging, offrendo opportunità uniche per il controllo ottico della funzione del terminale, la struttura e le loro interrelazioni. A quest'ultimo fine, abbiamo anche sviluppato ulteriormente per l'utilizzo in studi combinati ottici / elettrofisiologici (vedi articolo sorella Giove per i dettagli).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato finanziato da UK Medical Research Council progetto di sovvenzione G0601253 di GSB e RSF e una borsa SULSA Bioskape a GSB
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
