Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.
小説解剖と記録技術は、光監視染色およびマウスの耳介の皮膚に毛包を取り巻く披針形端子の脱染色のために記載されています。準備が確実に広範囲に小胞のリサイクルの研究で使用さスチリルピリジニウム色素の取り込みと放出を研究する神経終末を生きることの複数の標識された単位の大規模な領域を得、シンプルかつ比較的速いです。標識は、単一の個体から同じ耳における制御の比較対テストを可能にする前に準備を細分化。役立つヒントは、調製、標識および撮像パラメータの品質を向上させるために与えられます。この新しいシステムは、薬理学的アッセイおよび取り込み、これらの両方の野生型で披針形端子に不可欠な染料および遺伝子改変動物の解放を機械的に誘発されるのに適しています。標識強度の調節の影響の例が示されています。
彼らは通常、皮膚または他の周囲の組織の奥深くに埋もれているように機械刺激神経終末は、 その場でのアクセスに、一般的に小さな広く分布し、困難です。それらの可視化、したがって、通常は長期の免疫標識/染色期間、またはそのような緑や黄色蛍光タンパク質(GFP / YFP)1などの蛍光ラベルの遺伝子発現とマウス系統を得るための遅延と費用が続く切片が必要です。ここでは、便利な組織や研究のための毛包の求心性神経の多数へのアクセスを獲得するために迅速かつ簡単な方法を示し、それらはすぐに端末機能2の光学的監視のために標識することができますか。練習では、切開からの撮像に全体の技術は、わずか2時間で完了することができます。
感覚軸索の披針形端子はそれぞれに、哺乳動物における毛包は、毛包の上皮の周りに柵を形成支配しますグリア/シュワン細胞の間に挟まれた端末は、2-4を処理します 。端子の目的は、それらが取り囲む毛の機械的変位を検出することです。彼らは急速に、ゆっくりと適応語尾の混合物であるが、それらは主に髪の動きに応じて活動の短いバーストを生成します。動きがあっても継続的な変位の存在下で、停止するとき、通常、焼成は非常に迅速に停止します。
光学的方法によって披針形端子を研究するためのこのマウス耳介のモデルでは、これらの終末の構造と機能を研究するための多くの有利な特徴を持っています。耳介は、主に皮膚の二層の間の軟骨組織の量が少ないと、バックツーバック並置されています。皮膚は非常に薄く、簡単に起因する身体の他の部位に比べて弱く、接着剤、結合組織の最小量に解剖です。容易に分離表皮層は、したがって、卵胞および端末への良好なアクセスを与えます。神経支配簡単にアクセス可能と識別可能です。毛包は、よりまばら卵胞の個人または小グループのイメージングを容易に、他の皮膚領域よりも分布しています。薄い下層の真皮層は、そのようにさらに処理することなく、蛍光顕微鏡による撮影に最適です、染料および薬理学的薬剤への良好なアクセスを提供します。固定し、さらに組織学的処理の後、固定可能色素アナログを使用している場合はラベルされた端末のイメージングは、生きている端末であるか、いずれかです。
我々は、膜のリサイクルは披針形の語尾で起こることを示すために、この準備を使用し取り込み(エンドサイトーシス)によって証明し、スチリルピリジニウム色素(FM1-43の放出(エキソサイトーシス)している; N – (3-triethylammoniumpropyl)-4-(4- (ジブチルアミノ)スチリル)ピリジニウムブロミド)。染料は、しかし、かなりの投資シュワン細胞プロセス2にラベルを付けていないようです。また、この色素取り込み/リリースすることを示し、したがって膜R電子機器のリサイクル、非定型(ホスホリパーゼD-結合された)代謝型グルタミン酸受容体を介してグルタミン酸変調の対象となります。単純な刺激と分析プロトコルの結果が示されており、共通電位分析上の問題も強調されています。
ビューイックとベッツは、もともとシナプス小胞の膜の地域循環を監視するために、ピリジニウムジブロマイド関連スチリルピリジニウム色素7-10を N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(ジブチルアミノ)スチリル)を開発しました。色素取り込み、ひいては蛍光の増加、したがって、シナプス小胞の膜内在(エンドサイトーシス)を反映しています。続いて、この内在化色素は、さらに電気的活動によって再リリースすることができ、染料の損失を示すことは小胞膜の外部化(エキソサイトーシス)を監視します。シナプスでは、これは、神経伝達物質の分泌のためのプロキシです。同時に、我々はまた、これらの染料は、一次機械刺激神経終末7にラベルを発見しました。さらに最近では11、ビューイック、銀行や同僚は、これは成熟した、差別機械刺激端末のex vivoでの同様のプロセスを反映していることが示されました。グルタミン酸を放出するように構成的にリサイクルここで再び、染料ラベル50nmの直径「シナプス様」小胞(SLVS)。機械刺激の端末では、そのシナプスの対応とは異なり、このリサイクルは主に自発的です。また、機械的ではなく、単に電気刺激によって調節されます。
文化および蝸牛の有毛細胞における感覚ニューロンのために、一般、特にスチリルピリジニウム色素でスチリル色素は、機械刺激チャネルを遮断し、不可逆的に内部の膜12を標識し 、機械刺激チャネルを通過することが示されています。しかし、筋紡錘11で2、またはIaの終末で披針形語尾のように、ここでその場で差別機械刺激端末、で同等のスチリル色素の濃度でかつ機械的に13、14を刺激されていない有毛細胞では、標識は、膜のエンドサイトーシスによるものです。機械刺激神経終末では、例えば、標識が可逆的であり、2、11、1、ここで使用される濃度では機械刺激応答をブロックしません。これらの終末におけるチャネル透過による一部の染料内在化を完全に排除できないものの5。、ラトロトキシンとほぼ完全脱色は、成熟した端末で、標識の大部分はリサイクル小胞の膜と内在化することによってであることを示します。我々は、したがって、色素の取り込みと放出に対する薬物効果を調べることによって、最も最近では、機械刺激求心性端末でSLVリサイクルの薬理2を活性依存性11を研究するためにこの技術を使用するとしています。
最も実用的な技術と同様に、再現性が反復と練習が必要です。信頼性を確保するための重要な点のいくつかを説明します。若い動物での披針形の標識は、より信頼性がある – 私たちが使用している最小の動物は、15グラムの体重でした。これが事実である理由は、必ずしも明らかではないが、若い結合組織の切開が少なく、機械的外傷およびルを必要とするので、それであってもよいです神経支配層を覆う組織を除去する際に鳥類少ない残基を残り。
全体的に、組織標本は、皮膚層が離れて最も技術的に困難な実用的な側面であること剥離した後にのみ、古いマウスではと、非常に簡単です。これらには、皮膚層は解剖が起動しますが、ここでも層の分離は、余白に向かってはるかに容易になるベースで一緒に強く接着します。一般的に前方皮膚がそうであるようにありがたいことに、またはおそらくその結果、これらの薄い限界皮膚領域は、通常、最も満足の標識を与えます。そのため、特にマージンで非常に薄い皮膚を把握することは避けてください。損傷のリスクを最小限に抑えるために、閉じた鉗子で押すのではなく、直接把握することで、または本質的な把握が唯一の厳しい組織ラベル付けされる可能性が低い場合には、間接的に準備を操作します。これは主に私のようにすぐに、毛包の上にある「シートポリスチレン」層を除去するのに十分なことイメージングおよび薬物のアクセスにchanical閉塞。しかし、それだけで以下の根底にあるこの損害賠償などの構造( すなわち、剥ぎ)ニューラルネットワークと端末との物理的接触を最小限にすることが不可欠です。支配的な蛍光は皮脂腺、毛拠点と黄色/オレンジ披針形の語尾の数三日月の著名な自家蛍光の白/黄色の場合、これは神経叢層を示し、関連する披針形端子は、クリアランスの間に除去されています。これは、古い(> 30グラム)マウスを用いた主な問題であるように思われます。染色手順を通して、すべてが30℃であり、十分に酸素を確認してください。ラベルされた端末がまだ生きていることに注意してください。その結果、色素は、継続的な自発的(構成)エキソサイトーシスリリースにより分泌されます。これは、R / Tで遅くなりますが、染料の損失を最小限にするために、キレート剤溶液およびイメージングの除去の間の遅延を最小限にすることをお勧めします。また、群間の比較のために強度のtudies、それはすべてのグループの画像化を確実にするために不可欠なことは、時間的に整合します。イメージングの前に染料キレート剤の使用は、非常に画像のコントラストを向上させることができます。そこで、比較的高価ながら、キレート化ステップは、良好な画像品質を確保するために非常に重要です。使用の間、4℃で保存した場合、3日連続 – キレート剤の使用は、溶液を複数回再利用することにより、最小化、さらには2にすることができます。それは、その染料の隔離が飽和に近づいている示し、顕著にピンクの行く一度キレート剤液を捨てます。
撮影時には、強度と励起光の露光時間の両方の累積結果であるこれらの生活の端末に光毒性損傷の可能性、に注意してください。この考慮事項は、画質が主要な関心事である単一の時点の画像、のためにそれほど重要ではありません。しかし、最小の励起光曝露を低減するために動力学研究における繰り返し撮像中に重要です。これらの染料を開発している間ラベルのシナプスは、我々は神経末端への劇的な回復不能な損傷を与える可能性がありますフルパワーの励起照明で> 1分間の励起を見つけました。彼らはまず、その後、絶大な展開後、〜15分間かけて完全に崩壊します。我々は体系的に露光時間と強度の相対的な寄与をテストしていないが、これらの観察は、基本理念は、両方を最小化することであるべき示唆しています。だから、励起光の強度および持続時間は、良好な画像を得るに見合っ最小であり、かつ適切な制御画像は経時研究で取られることをお勧めします。データが繰り返し撮影条件の下で光毒性によって影響されないことをテストするために、各時点で、以前に未視聴端末の追加の画像を取ります。これはナイーブ端末内の標識の挙動は卵胞で繰り返し撮像されていることに似ているようにすることです。
多くの要因は、正味の強度Dの群内変動性を低減することができますATA。不適切な染色の小さな領域が大きく間、卵胞のデータの変動に影響を与えることができるようROIの正確な配置、特に背景ROIは、重要です。ネット強度の変動は、各毛包が語尾の柵で囲まれている方法を完全に影響されます。例えば、 図2に見られるほぼ完全に円形パターンを有する図1Bの三日月形の標識分布を比較してください。より複雑な分析、おそらくソフトウェアの自動検出としきい値を使用して、包囲の程度は、関連するパラメータである場合に必要です。最も正確に分析した卵胞のグループのための強度分布は、通常、人口の中央値ではなく、手段の間の処理の比較のためのノンパラメトリック統計の使用を必要とする、( 図3参照)は配信されませんのでご了承ください。このようなパーセンテージOなどの強度を表現するよう正規化技術、F対コントロール、またはいくつかの調製物からなる対照群、さらにばらつきを低減するために適用することができます。考慮すべき最後の技術的な項目は、薬理学的試験のための実験的なデザインです。薬理学的調査の間に、染料を適用する前の30分間の薬液で準備を事前にインキュベートします。その後、染料溶液中の薬物濃度を維持します。薬物は車両、生理食塩水を加えた車両に溶解された場合のコントロールでは、生理食塩水または、いずれかを使用します。
本資料では、この新しい耳介製剤は最小限の準備で皮膚に機械刺激終末の高品質の画像を提供しています方法を示しています。我々はまた、小胞のリサイクルの2つの重要な側面の薬理学を調べるために使用できることを示します。私たちは、グルタミン酸受容体アゴニストは色素の内在(エンドサイトーシスのマーカー)を増加させることができ、そして第二に、その色素はラトロトキシン(エキソサイトーシスの刺激剤)で再度失われていることを最初に示しています。このpreparatの意義イオンおよび技術は、端末の機能、構造およびそれらの相互関係の光学的監視のためのユニークな機会を与える、イメージング実験のためにその場で皮膚mechanosenory端子を生きへの優れたアクセスを提供することです。この後者の目的のために、我々はまた、結合された光/電気生理学的研究(詳細については、姉妹Joveの記事を参照してください)で使用するためにさらにそれを開発しました。
The authors have nothing to disclose.
作業は、英国医学研究審議会のプロジェクト助成GSBにG0601253とRWBとGSBへSULSA Bioskapeの助成金によって賄われていました
PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |