Summary

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-ריאתי

Published: March 11, 2016
doi:

Summary

Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

Abstract

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.

Introduction

לויקוציטים דבקים בנימי הריאות (כלומר, marginating-ריאתי (MP) לויקוציטים) 1 הוצג להציג רכב לויקוציטים ברור פעילות ייחודית לעומת לויקוציטים מ תאים חיסוניים אחרים (למשל, מחזור, טחול, מח עצם) 2- 4. לדוגמה, MP-לויקוציטים התערוכה גבוה הרג טבעיים (NK) cytotoxicity התאים מפני תאים סרטניים שונים, לעומת מחזורי הטחול תאי NK, כמו גם RNA שליח הבדיל (mRNA) רמות הפרשה מוגברת של ציטוקינים פרו ואנטי דלקתיים. הרכב של תאים הוא מובחן גם לויקוציטים במחזור כמו שיש MP-לויקוציטים יחס גבוה יותר של חסינות אדפטיבית / מולד לעומת לויקוציטים במחזור (50% לעומת 30%, בהתאמה). מטרת השיטה המוצגת כאן היא לאפשר קצירת סלקטיבית של MP-לויקוציטים, כדי ללמוד תא החיסון חשוב וייחודי זה (אוכלוסיית תאים), וכדי elucidate השפעת מניפולציות שונות (למשל, הפעלה חיסונית) על תאים ספציפיים אלה.

כדי להבין את המשמעות של אוכלוסייה ייחודית זו, חשוב לציין כי מערכת החיסון יכולה לשלוט במחזור תאים סרטניים, micrometastases, ומחלות שיורית באמצעות פונקציות vivo של חסינות בתיווך התא (CMI). יכולת זו באה לידי ביטוי למרות כישלון התקדים של מערכת החיסון על מנת לשלוט בגידול הראשוני, ונתמך על ידי מספיק ראיות vivo בחולי סרטן ומודלים של בעלי חי 5. חשוב לציין, הממצאים הללו הם לעתים קרובות עולה בקנה אחד עם במבחנה במחקרים vivo לשעבר, אשר מדווחים כי רוב תאי הגידול עצמיים עמידים cytotoxicity ידי מחזורי לויקוציטים בדגימות דם מבני אדם ובעלי חיים (נמדד על ידי מבחני רעילות) 6,7. אי התאמה זו ניתן לייחס לקיומה in vivo של אוכלוסיות לויקוציטים שונות, כגון שצויןאוכלוסייה לויקוציטים MP נזכרת, ו-האוכלוסייה שלה במיוחד של תאי NK מופעלים 3. ואכן, תאים סרטניים syngeneic (MADB106), אשר נמצאו להיות עמיד במחזור לויקוציטים טחול, הוצגו להיות lysed ידי תאי MP-NK 3,8. לפיכך, התאים MADB106 'NK עמיד' לכאורה כי גרורות לריאות של fischer344 (F344) חולדות נשלטים על ידי תאים MP-NK, אבל לא על ידי מחזורי או תאי NK הטחול, אשר בדרך כלל נלמדים נתון קלות הגישה שלהם.

מטוהרים פעילים MP-לויקוציטים אינם נגישים באמצעות שיטות קציר רמה לויקוציטים מהריאות, אשר מבוססות על שחיקה רקמת ריאה או 9 שפלה ביולוגית. הגישה שלנו כוללת שני יתרונות מרכזיים לעומת גישות עיבוד רקמות. ראשית, גישת זלוף סלקטיבי יבול MP-לויקוציטים, תוך הפרדה תאים אחרים שמקורן parenchymal ריאות, ביניים, ו compar broncho-מכתשיםtments. שנית, טכניקת זלוף טוב יותר שומרת על השלמות ובין ההוויה הפיזיולוגית של לויקוציטים MP, בניגוד שחיקה והעיבוד ביולוגי גישות הפוגעים בתאים, לשנות המורפולוגיה שלהם, ולגרום לייצור ושחרור של גורמים שונים כי לווסת את הפעילות חיסונית במיוחד לדכא NK cytotoxicity 10.

הריאות הן איבר יעד מרכזי עבור גרורות סרטן ועבור מחלות זיהומיות שונות. כל התאים הממאירים במחזור התאים נגועים לעבור דרך נימי הריאות, בה הם צריכים לעוות ולתקשר עם תאי אנדותל נימים לויקוציטים תושב. בתנאים אלה, תאים במחזור יכולים להיות ממוקדים בקלות על ידי-לויקוציטים MP תושב. נראה, אם כן ביולוג יתרון יש לויקוציטים מופעלים בתא החיסון הזה, וזה חשוב ללמוד אוכלוסייה-MP הייחודית זאת בהגדרות ביולוגיות, ניסיוני, וקליניים שונים. ראוי לציין כי סאיההפעלה החיסונית stemic ידי-מכפילי ביולוגי-תגובה שונות (למשל, חומצה polyinosinic-polycytidylic (פולי לי: C) או מסוג C CPG oligodeoxynucleotides (CPG-C ODN)) הוכחו להפעיל MP-לויקוציטים יותר לויקוציטים במחזור 3, 8,11.

Protocol

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת תל-אביב. 1. עכברוש פרוטוקול תכשירים מסדרים …

Representative Results

תערוכת MP-תא קומפוזיצית משנה לויקוציטים שונה לעומת מחזורים לויקוציטים. באמצעות ניתוח תזרים cytometry, תת-אוכלוסיות לויקוציטים זוהו לכמת ולאפיין את הרכב של שני מחזורי לויקוציטים MP. גרנולוציטים ו לימפוציטים זוהו מבוסס על מחליקי קדימה והצד. בתוך לימפוציטי…

Discussion

השיטה המוצגת כאן מאפשרת קצירת סלקטיבית ולומדים של האוכלוסייה הייחודית של לויקוציטים MP. לעומת מחזורי או לויקוציטים טחול, אוכלוסיית MP מאופיינת רכב מובהק של תת-אוכלוסיות לויקוציטים, רמות הפעלה גבוהות, שחרור גבוה של ציטוקינים שונים, ורמות גבוהות יותר של mRNA תומך ציטוקינ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים ועבודה זו נתמכו # מענק NIH / NCI R01CA172138 (כדי SBE).

Materials

Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle OMG 26G
Butterfly needle OMG 21G*3/4"
Syringe Pic solution 1 ml
Syringe Pic solution 2.5 ml
Syringe Pic solution 5 ml
Syringe Pic solution 10 ml
Syringe Pic solution 25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) Sigma Aldrich

References

  1. Kuebler, W. M., Goetz, A. E. The marginated pool. Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).
  2. Benish, M., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunol Res. 58, 28-39 (2014).
  3. Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
  4. Shakhar, G., et al. Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis. Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).
  5. Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).
  6. Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice. Nature. 284, 622-624 (1980).
  7. Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).
  8. Melamed, R., et al. Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor. Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).
  9. O’Dea, K. P., et al. Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia. Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).
  10. Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. , (2014).
  11. Levi, B., et al. Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12). Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).

Play Video

Cite This Article
Shaashua, L., Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, S. Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes. J. Vis. Exp. (109), e53849, doi:10.3791/53849 (2016).

View Video