Selectief oogsten van Marginating-pulmonaire Leukocyten
Summary
Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.
Abstract
Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.
Introduction
Leukocyten zich te houden aan de haarvaten van de longen (dat wil zeggen, marginating-pulmonaire (MP) leukocyten) 1 werd aangetoond dat verschillende leukocyten samenstelling en unieke activiteit vertonen in vergelijking met leukocyten uit andere immune compartimenten (bv, circulatie, milt, beenmerg) 2- 4. Bijvoorbeeld, MP-leukocyten vertonen hogere natural killer (NK) cellen cytotoxiciteit tegen verschillende tumorcellen, in vergelijking met circulerende en milt NK-cellen, evenals gedifferentieerde messenger RNA (mRNA) niveaus en verhoogde uitscheiding van pro- en anti-inflammatoire cytokines. De samenstelling van cellen is ook onderscheiden van circulerende leukocyten als MP-leukocyten een hogere verhouding van aangeboren / adaptieve immuniteit in vergelijking met circulerende leukocyten (50% vs. 30%, respectievelijk). Het doel van de werkwijze die hierin wordt selectief oogsten van MP-leukocyten activeren om deze belangrijke en unieke immuuncompartiment (celpopulatie) bestuderen en elucIDATE de impact van verschillende manipulaties (bijvoorbeeld activering van het immuunsysteem) op deze specifieke cellen.
De betekenis van deze unieke populatie begrijpen, is het belangrijk op te merken dat het immuunsysteem regelen circulerende tumorcellen, micrometastasen en residuele ziekte door in vivo functies van celgemedieerde immuniteit (CMI). Dit vermogen blijkt ondanks het precedent falen van het immuunsysteem om de primaire tumor te controleren, en ondersteund door ruime in vivo bewijs kankerpatiënten en diermodellen 5. Belangrijk, deze bevindingen vaak inconsistent met in vitro en ex vivo studies die aangeven dat de meeste autologe tumorcellen resistent tegen cytotoxiciteit van circulerende leukocyten in bloedmonsters van mensen en dieren (gemeten cytotoxiciteit assays) 6,7. Dit verschil kan worden toegeschreven aan de in vivo aanwezigheid van verschillende leukocyt populaties, zoals de hiervoorgenoemde MP leukocytpopulatie en specifiek de subpopulatie van geactiveerde NK-cellen 3. Inderdaad, syngene tumorcellen (MADB106), die bleken resistent tegen circulerende leukocyten en milt zijn, bleken worden gelyseerd door MP-NK-cellen 3,8. Zo is de zogenaamd "NK-resistente 'MADB106 cellen die uitzaaien naar de longen van fischer344 (F344) ratten worden gecontroleerd door MP-NK-cellen, maar niet door het circuleren of milt NK-cellen, die gewoonlijk worden bestudeerd vanwege hun gemakkelijke toegang.
Gezuiverde en actieve MP-leukocyten zijn toegankelijk via de standaard oogstmethodes leukocyten uit de longen, die gebaseerd zijn op longweefsel vermalen of biologische afbraak 9. Onze aanpak heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van weefselverwerking benaderingen. Ten eerste, de perfusie aanpak oogst selectief MP-leukocyten, die hen scheidt van andere cellen die afkomstig zijn van de long parenchymale, interstitiële en broncho-alveolaire compartments. Ten tweede, de perfusie techniek beter behoudt de integriteit en de fysiologische milieu van MP-leukocyten, in tegenstelling tot het malen en biologische verwerking benaderingen die cellen beschadigen, verandering van hun morfologie, en induceren de productie en afgifte van verschillende factoren die het immuunsysteem moduleren en specifiek onderdrukken NK 10 cytotoxiciteit.
De longen zijn een belangrijk doelorgaan voor kanker metastase en verschillende infectieziekten. Alle circulerende maligne cellen en geïnfecteerde cellen passeren de longen haarvaten, waar ze moeten vervormen en interactie met capillaire endotheelcellen en resident leukocyten. Onder deze omstandigheden kunnen circulerende cellen gemakkelijk worden gericht op resident MP-leukocyten. Het lijkt derhalve gunstig biologisch geactiveerde leukocyten in deze immuuncompartiment, en het is belangrijk om deze unieke MP-populatie studie in verschillende biologische, experimentele en klinische settings. Het is het waard om op te merken dat systemic immune activering door verschillende biologische-respons-modificatoren (bijvoorbeeld polyinosinic-polycytidylic acid (poly I: C) Soort-C CpG oligonucleotiden (CpG-C ODN)) is aangetoond dat MP-leukocyten meer dan circulerende leukocyten 3 activeren 8,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
De werkwijze die hierin gepresenteerde maakt het selectief oogsten en het bestuderen van de unieke populatie van MP-leukocyten. Vergeleken met circulerende leukocyten of milt, de MP populatie karakteristiek met bijzondere samenstelling van leukocytsubpopulaties, hogere activeringsniveaus, hogere afgifte van verscheidene cytokinen en hogere mRNA niveaus van pro- en anti-inflammatoire cytokines 2,3. Specifiek hebben we aangetoond dat MP-NK-cellen zijn cytotoxischer dan bloedsomloop NK cellen tegen verschillende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs en dit werk werd ondersteund door NIH / NCI subsidie # R01CA172138 (tot SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
References
- Kuebler, W. M., Goetz, A. E. The marginated pool. Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).
- Benish, M., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunol Res. 58, 28-39 (2014).
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Shakhar, G., et al. Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis. Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).
- Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).
- Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice. Nature. 284, 622-624 (1980).
- Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).
- Melamed, R., et al. Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor. Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).
- O’Dea, K. P., et al. Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia. Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).
- Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. , (2014).
- Levi, B., et al. Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12). Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).
