최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

유전자 변형 쥐를 포함 하는 절차는 뇌 과학에 대 한 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 알 렌 연구소에 의해 승인 되었습니다. 둘 다 남성과 여성 C57BL/6 쥐 (체중 범위 10-30 g)이이 실험에서 사용 되었다. 일부 대표적인 결과 살아있는 인간 두뇌 조각에서 수집 된 데이터를 설명 합니다. Neocortical 조직 표본은 종양 제거를 위한 neurosurgeries 동안 얻은 했다. 그것은 병에 걸리는 조직에 대 한 액세스를 얻기 위해 overlying neocortical 조직을 제거 하는 데 필요한 했다. 정보 환자 동의 스웨덴 의료 센터의 기관 검토 위원회에 의해 승인 프로토콜에서 연구 목적에 대 한 신경외과 조직의 사용에 대 한 모든 사례에서 얻은 했다. 1. 미디어와 시 약 (표 1)의 준비 참고: 솔루션 여야 한다 하 추적 금속 및 기타 불순물의 순화 된 물에서. 사용 하지 않는 솔루션 저장 될 수 있습니다 4 ° C에서 최대 1 주에 대 한 원하는 경우 비록 솔루션 실험의 날에 갓 만든 수 것이 좋습니다. 위의 각 배합의 1 L 1-2 조각화 절차에 대 한 충분 하다. 모든 실제 솔루션은 안정적인 pH 버퍼링 하 고 충분 한 산소를 사용 하 여 이전 carbogen (95% O2/5% CO2)와 함께 포화 상태 해야 합니다. 모든 솔루션의 pH 7.3-7.4 및 osmolality 조정 되어야 한다 측정 하 고 300-310 mOsmol/kg을 조정. (MM)에 NMDG HEPES 실제 준비: 92 NMDG, 2.5 KCl, 1.25 NaH2포4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 포도 당, 2 thiourea, 5 나 하는데, 3 Na-pyruvate, 0.5 CaCl2·2H2O, 및 10 MgSO4·7H2O. Titrate pH 7.3 5m 염 산의 0.5 mL + 17 mL와 함께 –7.4.참고:이 적정 단계 적으로 수행 해야 피하기 위해 강 수; divalent 양이온의 추가 사전 그러나, 강 수 pH의 조정에 따라 생리 적인 범위를 되돌릴 수 있습니다. HEPES (mM)에서 실제 들고 준비: 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2포4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 포도 당, 2 thiourea, 5 나 하는데, 3 Na-pyruvate, 2 CaCl2·2H2O, 그리고 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH를 7.3-7.4의 몇 방울과 집중 10 N NaOH. (MM)에 녹음 실제 준비: 124 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2포4, 24 NaHCO3, 12.5 포도 당, 5 HEPES, 2 CaCl2·2H2O, 그리고 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH를 7.3-7.4의 몇 방울과 10 N NaOH를 집중. 솔루션 스파이크에서 Na+ (2m) 준비: NaCl의 580 mg 갓된 NMDG HEPES 실제의 5 mL에 용 해. 이것은 하나의 두뇌 슬라이스 준비에 대 한 충분 한 솔루션 이다. 조직을 포함 하는 데 사용할 2 %agarose 준비 합니다. Agarose 형식 1B의 2 세대 분해 ( 재료의 표참조) 그냥 끓는 때까지 PBS와 전자 레인지 x 1의 100 ml에서. 혼합, 그리고 무 균 10 cm 배양 접시에 혼합물을 부 어 응고 허용에 소용돌이 친다. 사용 될 때까지 4 ° C에서 봉인된 된 비닐 봉투에 agarose 접시를 저장 합니다. 재고 솔루션을 작동 하는 주 사용 마 취 준비. 2-메 틸-2-butanol의 5 mL와 2,2,2-Tribromoethanol의 2.5 g을 혼합 하 고 점차적으로 200 mL PBS, pH 7.0-7.3에에서 용 해. 사용 하기 전에 0.22 μ m 필터 재고 솔루션을 필터링 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 저장.참고: 재고 솔루션을 작동 하는 마 취에 대 한 만료 및 폐기 절차를 결정 하기 위한 각 동물 사용 위원회 지침 및 규칙을 참조 하십시오. 2입니다. 저 미 역의 설정 조직 기계 기계와 수술 도구 ( 재료의 표참조) 저 미 역을 설정 합니다. 기계 기계 보정, 지르코늄 세라믹 인젝터 블레이드를 블레이드 팔 빠른 접착제 접착제를 사용 하 여 연결한 다음 견본 홀더를 삽입 하 고 블레이드 긁어 하지 않습니다 보장 하기 위해 작은 차이 떠나 견본 홀더를 잎의 앞 가장자리를 정렬 금속입니다.참고: 블레이드 가장자리 물리적으로 손상 되지 않은 경우 주 또는 심지어 많은 대 한 다시 사용할 수 있습니다 교체 하지 않고 달. 다양 한 조직 기계 모델은 상업적으로 사용할 수 있는, 많은 최적의 보정 때 우수한 성능을 제공할 수 있습니다. 이상적인 최소 z 축 편향, 직접 측정 하 고 조정 또는 경험적으로 관찰 해야 합니다. 250 mL 비 커에 대 한 상수 carbogenation (가스 기관총 돌 미디어에 몰입을 통해 적용) NMDG-HEPES 실제와 얼음에 사전 오 200 mL와 함께 가득 설정 > 10 분.참고:이 솔루션 사용 됩니다 transcardial 관류 및 단면 중 슬라이스 기계 저수지를 채우는. NMDG-HEPES 실제의 150 mL 가득 초기 뇌 조각 복구 챔버를 설정 (상수 carbogenation 유지) 챔버 32-34 ° c.에 유지 온수 물 욕조에 배치참고: 디자인 후 슬라이스 챔버 에드워즈와 Konnerth (1992)의52 이 단계에 대 한는 것이 좋습니다. 이 챔버는 쉽게 사용할 수 있는 실험실 항목으로 만들어질 수 있다 (250 mL 비이 커, 나일론 메시 그물 세공, 50 mL 원뿔 튜브, 35 m m 플라스틱 원형 접시). 그 남아 공기의 무료 그물 조각 거품, 특히 그 조각을 플 로트 하 여 손상 될 발생할 수 있습니다 이러한 carbogen 가스 거품 돌에 의해 지속적으로 생산 되도록 주의 해야 합니다. 그물 액체 표면 아래 약 1 cm 침수 한다. 들고 챔버; 뇌 슬라이스를 설정 큰 저수지에 여러 독립적인 웰 스와 디자인 좋습니다 ( 재료의 표참조). 사용까지 HEPES 실제와 따뜻한 일정 carbogenation에서 실내 온도에 450 mL로 저수지를 채우십시오.참고: 두뇌 분할 영역 전송 됩니다 초기 복구 상공에서 electrophysiological 녹음 하기 전에 장기 저장에 대 한이 약 실에. 그 기포의 무료 조각 그물 남아 항상 되도록 주의 해야 합니다. 조직 포함을 위한 녹은 agarose를 준비 합니다. 쿠키 커터 처럼 50 mL 원뿔 유리병의 오픈 엔드를 사용 하 여 이전 준비 접시에서 2 %agarose 블록을 잘라. 느슨하게 원뿔 유리병 뚜껑 다음 전자 렌지에 10-30 s는 agarose 그냥 녹아 때까지. 과열 하지 않습니다. 1.5 mL 튜브에 녹은 agarose를 부 어. Agarose 활기찬 동요와 42 ° C로 설정 하는 thermomixer를 사용 하 여 녹은 상태에서를 유지 합니다. 신중 하 게 녹은 agarose 성급 하 게 응고 하지 않습니다 확인 합니다. 전이 이번에 시원한 얼음에 slicer에 대 한 블록을 재미 액세서리를 놓습니다. 3. Transcardial 관류 참고: transcardial 관류 절차 성인 동물을 작업할 때 중요 한 단계는 두뇌의 급속 한 냉각을 달성 하는 것이 중요 하다 고 낮은 나+의 뇌 주입을 통해 신진 대사를 둔화, 저 캘리포니아2 +/ Mg2 + 실제 솔루션입니다. Transcardial 관류 뇌 맥 관 구조, 시각화 및 유전자 변형 라인에 붙일 레이블된 셀 인구의 타겟팅 방해할 수 있는 autofluorescence를 감소 시키는에서 붉은 혈액 세포를 또한 제공 합니다. 그건 transcardial 관류를 생략 하는 것이 좋습니다. 깊이 복 주입 마 취 작업 재고 솔루션의 마우스 anesthetize (1.25% 마 취의 250 mg/kg: 0.2 mL 당 10 g 몸 무게 재고 솔루션을 작업 참조 하십시오 테이블의 자료). 후 ~ 2-3 분, 발가락 핀치 반사를 평가 하 여 마 취의 충분 한 깊이 확인 합니다. 필요한 경우 주사 마 취 작업 재고의 볼륨을 추가 하 고 다른 2-3 분 후 발가락 핀치 반사를 재평가. 미리 냉장된 250 mL 비 커 (2-4 ° C 최적입니다, 눈 녹은 냉동된 솔루션이 아닌)에서 carbogenated NMDG HEPES 실제의 25 mL로 30 mL 주사기를 로드 합니다. 25 5/8 게이지 바늘을 연결 합니다. 그것의 뒤에 마우스로 forepaws 및 안정성에 대 한 뒷 발 아래로 핀. 15 cm 유리 페 트리 접시는 기본으로 잘 강화 된 실리콘 작품으로 가득합니다. 메스를 사용 하 여 횡 경 막의 수준에서 흉 강 측면 절 개를 확인 합니다. 좋은 위를 사용 하 여 어느 쪽 돌 심 혼 및 폐를 클리핑 방지 하기에 흉 곽을 통해 잘라. 다시 핀 노출 심장 흉 곽의 중앙 부분. 좌 심 실에 30 mL 주사기의 바늘을 삽입 하 고 오른쪽 아 트리 움 마음을 종료 하려면 혈액 수 있도록 잘가 위로 잘라. 수동 일정 한 압력을 사용 하 여 주사기 플런저를 우울 하 게 하 고 ~ 10 mL/min의 속도로 냉장된 NMDG HEPES 실제와 동물을 perfuse.참고: 경우는 관류 성공적인 간 변경 됩니다 색깔 홍 색에서 옅은 노란색, 그리고 어떤 경우 명확한 종료 프로시저의 끝으로 콧구멍 체액을 관찰할 수 있다. 4. 뇌의 해 부와 슬 라이 싱 동물을 목을 벨. 메스를 사용 하 여 머리에 피부를 열고 두개골 모자를 노출. 두개골 모자를 통해 피부를 버려야 고 작은 절 개 옆에 꼬리/복 부 양쪽에는 두개골의 기본 사용 괜 찮 아 요 슈퍼 컷이 위. 기본 두뇌를 손상 하지 않도록 주의 복용 등 중간까지 rostral 방향에서 이동 하는 두개골의 꼬리 등 쪽 부분에서 시작 하는 추가 얕은 상처를 확인 합니다. ‘ T는 최종 확인 ‘ 후 각 전구의 수준에는 중간에 수직을 잘라.참고: 합니다 주의 관심의 두뇌 지구에 아무 피해를 보장 하기 위해. 특히, 한번도 거기 이어야 한다 뇌 자체에 적용 되는 어떤 압축 힘. 라운드 팁 집게를 사용 하 여 파악 rostral 중간 부분에서 시작 하는 두개골과 꼬리 옆 방향으로 다시 껍질. 균열을 양쪽 모두에 대 한 반복 열고 노출 뇌 두개골 모자 등 절반을 제거. 부드럽게 미리 냉장된 NMDG HEPES 실제의 비 커에 그대로 뇌 밖으로 특 종. ~ 1 분 균일 하 게 냉각 하기 위하여 두뇌를 허용 합니다. 큰 주걱을 사용 하 여 비 커 그리고 필터 종이로 덮여 페 트리 접시에 두뇌를 들어올립니다. 트림 하 고 두뇌 슬 라이 싱의 기본 각도에 따라 원하는 관심 뇌 영역을 차단 합니다. 처리 중 장기간된 산소 부족을 피하기 위하여 신속 하 게 작동 합니다.참고: 많은 조각화 각도 수 있습니다. 정확한 차단 방법 및 슬라이스 각도 정확한 뇌 영역, 셀 유형, 그리고 회로 공부에 따라 달라 집니다. 두뇌 블록 접착제 접착제를 사용 하 여 견본 홀더를 부착 충분히 완벽 하 게 내부 뇌 블록을 철회 견본 홀더 내부 조각 철회. 두뇌 블록은 agarose 완전히 덮여 때까지 소유자에 직접 녹은 agarose를 붓는 다. 사전 냉각된 액세서리 재미 ~ 10 견본 홀더 주위 블록 클램프 s는 agarose는 경화 될 때까지. 기계 기계에 콘센트에 견본 홀더를 삽입 하 고 적절 한 맞춤을 확인 합니다. 250 mL 비 커에서 나머지 미리 냉장, 산소 NMDG HEPES 실제와 저수지를 충분 한 산소를 되도록 자르는 동안 저수지에 거품 돌을 이동. Agarose 포함 뇌 견본 발전 하려면 마이크로 미터를 조정 합니다. 슬라이서를 시작 하 고 경험적으로 원하는 단계로 사전 속도 진동 주파수를 조정 합니다.참고: 설정이 모두 낮은 범위에 있어야 합니다. 최상의 결과 얻으려면 단일 생산 해야 합니다 걸릴 약 20 s와 진동 한다 명백한 맴 돌아와 매우 매끄럽고 부드러운 허 밍 소음 블레이드 팔의 전달 합니다. 계속 발전 하 고 300 µ m 증가 (또는 다른 원하는 두께) 뇌 영역까지 관심의 조직 부 러 뜨 리는 구분 완전히; 조각화 절차에 대 한 총 시간 15 분 미만 이어야 합니다. 5. 최적화 된 NMDG 보호 복구 절차 초기 NMDG 복구 단계 (중요 한 단계): 단면 절차의 완료, 모든 조각을 잘라 플라스틱 파스퇴르 파이프 t를 사용 하 여 수집 하 고 150 mL 가득 미리 따뜻하게 (34 ° C) 초기 복구 챔버로 전송 NMDG-HEPES 실제입니다. 짧은 승계에서 모든 분할 영역을 전송 하 고 모든 조각 복구 상공으로 이동 됩니다 타이머를 시작. 마우스의 연령에 따라 일정 스파이크에 최적의 나+ 확인 하려면 표 2 를 참조 하십시오.참고:이 절차 뇌 조각 챔버로 나+ 의 재 소개의 제어 속도 달성 하는 실용적인 방법을 이며는 최적화는 특정 뇌 조각 챔버 형상과 저수지 볼륨 종류 ( 재료의 표참조). 에 제시 된 솔루션 스파이크에서 Na+ 의 지정 된 볼륨을 추가 하 여 절차 스파이크에 stepwise 나+ 를 실행 시간. 빠른 혼합을 촉진 하기 위하여 초기 복구 챔버의 bubbler 굴뚝에 직접 솔루션 스파이크에서 Na+ 를 추가 합니다. HEPES 실제 장기 보유 약 실에 실 온에서 유지 모든 분할 영역을 전송 합니다. 조각 패치 클램프 기록 실험 시작 전에 챔버를 들고 HEPES에 추가 1 시간에 대 한 복구를 허용 합니다. 6. 패치 클램프 기록 참고: 다음 기본 절차 단지 제공 하는 몇 가지 실용적인 고려 사항 및 이러한 찾을 수 있습니다 다른53,54패치 클램프 기록에 대 한 상세한 프로토콜을 대표 하기 위하지 없습니다. 패치 클램프 전기 생리학 장비는이 응용 프로그램에 대 한 필요 합니다. 이것은 일반적으로 적외선 차동 간섭 콘트라스트 (IR-DIC) 광학 장비 직 립 현미경의 구성 됩니다 및 형광 조명 시스템, 패치 클램프 증폭기 및 데이터 디지타이저, 동력 micromanipulator 및 현미경 플랫폼, 진동 절연, 패러데이 케이지, 테이블과 솔루션 난방 및 관류 시스템. 시료 챔버와 플랫폼 침수 슬라이스 기록을 위해 설계 되어야 한다. 다중 신경 패치 클램프 기록, 여러 앰프, 헤드 단계, 및 높은 품질 micromanipulators rig가 필요 합니다. 또한, 최상의 결과 얻으려면 rig 900 nm 적외선 대역 통과 필터를 장착 하 고 광학 구성 요소를 일치 하는 것이 좋습니다 있는 셀의 적절 한 시각화 되도록 > 50 µ m 깊은 두뇌 조각에서. Kӧhler 조명에 대 한 적절 한 정렬도 분명 시각화에 대 한 중요 하다. (MM)에 세포내 피펫은 솔루션 준비: 130 K-구 루 콘, 4 KCl, 10 HEPES, 0.3 EGTA, 10 phosphocreatine 나2, 4 MgATP, 0.3 나2-GTP와 13.4 biocytin. 1 m 코 7.35에 pH 및 osmolality 285-290 mOsmol/kg 자당을 사용 하 여 필요에 따라 조정 합니다. 패치 클램프 전극 두꺼운 붕 규 산 유리 모 세관;에서 준비 이상적인 패치 클램프 전극은 상대적으로 짧고 짧고 테이퍼 ~ 3-6 MOhm 가득 욕조에 팁 저항. 전극 와이어 제대로 안정적인 녹음을 보장 하기 위해 chlorided 인지 확인 합니다. 이렇게 마지막 물속 여 (일반) 은색의 3-4 m m 와이어 액체 표 백제 또는 와이어 검게 될 때까지 약 30 분 동안에. 솔루션 관류 오버플로가 발생 하지 않도록 유입 및 유출 일치 하도록 녹음 챔버를 통해 실제 기록 3-4 mL/분 배포 carbogenated 설정 연동 펌프를 사용 하 여 설정 합니다. 단일 뇌 조각 침수 녹음 실로 전송 하 고 안전 장소 나일론 U 모양 조각 앵커를 사용 하 여 교차 문자열. 높은 전원 목표 (예를 들어, 높은 수 가늠 구멍 또는 60 X 40 X 물 침수 목표)으로 전환 하기 전에 4 X 어 목표를 사용 하 여 대상 뇌 영역을 식별 합니다. 시각적으로 건강 한 목표 셀을 식별 합니다. soma에는 신경 막의 모양은 IR DIC 현미경에 의해 시각으로 패치 클램프 기록에 대 한 후보 셀의 적합성을 판단 하 사용 된다.참고: 건강 한 신경 일반적으로 다음과 같은 기능을 전시: 수축 된도 somata, 막 가장자리, 그리고 부드러운 막 외관의 부드러운 대비를 부 어. 또한, 건강 한 세포의 대부분은 위치 > 30 µ m는 조각에 깊은 표면 신경 세포는 손상 될 가능성이 절단 수지상 프로세스. 남기고 모습을, 명확 하 게 보이는 핵 또는 ‘계란 튀김’ 모습, 또는 매우 어둡거나 높은 대비 막 가장자리는 뉴런은 피해 야 한다. 다시 채우기는 세포내 솔루션의 ~ 5 µ L로 플라스틱 패치와 전극 홀더에 그것을 로드. 피펫으로 뇌 조각 위에 녹음 목욕으로 이동 하 고 가벼운 긍정적인 압력에 있는 장애물을 제거 하. 피 펫 오프셋 0 고 막 테스트 기능을 사용 하 여 팁 저항을 모니터링 합니다. 이동 대상 신경 셀 시체; 접촉 피 펫 팁 작은 보조 개는 빛 긍정적인 압력 때문에 막 표면에 형성 한다. 최대한 빨리 막 보조 개 관찰 신속 하 게 긍정적인 압력을 제거 하 고 부드러운 흡입 물개 형성 촉진을 적용. 일단 피 펫 저항 증가 > 100 MOhm 예상된 휴식 막 일치 하는 수준으로 지주 명령 대상된 셀 형식에 대 한 잠재적인 설정 (-70 mV는 좋은 시작 지점). 일단 팁 저항 ≥1 gigaohm에 도달, 날카로운 흡입;의 간단한 관찰을 사용 하 여 패치 피 펫 아래 막 파열 하 여 셀에 침입 하려고 ‘써’ 기능 필요에 따라 휴식을 촉진 하기 위하여 이용 될 수 있습니다.참고:-70의 지주 잠재력 mV 전압 클램프 실험 대뇌 피 질의 뉴런에 대 한 제안. 건강 한 신경 해야한다 현재 누설-100 pA 보다 더 부정적인 실험의 기간에 대 한 하지만이 부분에 셀 형식에 따라 달라 집니다. 휴식 막 잠재력은-50 보다 더 depolarized 경우 신경 분석에서 제외 될 것 이다 mV, 또는 액세스 저항 20% 이상 변경 하는 경우. 안정적인 전체 셀 패치 클램프 기록 얻은 단계 6.6-6.10을 반복 하 여 녹음에 대 한 추가 뉴런을 대상. 첫 녹음을 잃고는 기계적 장애를 피하기 위해 주의. 100 µ m 이내 추가 뉴런 synaptically 결합 뉴런을 찾는 합리적인 가능성을 보장 하기 위해 첫 번째 신경에서 선택 합니다.참고: 그것은 경우에 따라 여러 후보 뉴런 앞을 식별 하 고 사전 로드 하 고 미리 첫 번째 패치 클램프 기록을 수립 하기 전에 다양 한 타겟된 세포에 가까운 모든 펫 위치 도움이 될 수 있습니다.