JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

إعداد شرائح الدماغ الحادة باستخدام محسن N-الميثيل-د-أسلوب استرداد واقية جلوكاميني

Published: February 26, 2018
doi:
10.3791/53825
, , , , , , ,
1Cell Types Program,Allen Institute for Brain Science, 2The Ben and Catherine Ivy Center for Advanced Brain Tumor Treatment,Swedish Neuroscience Institute

Summary

يوضح هذا البروتوكول تنفيذ الأمثل N-الميثيل-د-أسلوب استرداد واقية جلوكاميني (نمدج) من إعداد شريحة الدماغ. يتم استخدام صيغة وسائط واحد موثوق بها الحصول على شرائح المخ السليمة من الحيوانات من أي سن وتطبيقات تجريبية متنوعة.

Abstract

هذا البروتوكول دليل عملي لأن N-الميثيل-د-أسلوب استرداد واقية جلوكاميني (نمدج) من إعداد شريحة الدماغ. العديد من الدراسات الأخيرة أقرت بفائدة هذا الأسلوب لتعزيز المحافظة على الخلايا العصبية وبقاء شريحة الدماغ عموما. وسهلت تنفيذ هذا الأسلوب من أوائل الشركات التي تبنته تحقيقات مفصلة في وظيفة المخ باستخدام تطبيقات تجريبية متنوعة والتي تغطي مجموعة واسعة من الإعمار الحيواني ومناطق الدماغ وأنواع الخلايا. ويرد خطوات للقيام بالاسترداد واقية الدماغ شريحة تقنية استخدام الأمثل نمدج السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام) وسائط الإعلام صياغة وإجراءات تعزيز موثوقية الحصول على شرائح المخ السليمة لتصحيح المشبك الكهربية. مع هذا النهج المحدث، ويلاحظ تحسن كبير في السرعة وموثوقية جيجاوهم ختم تشكيل أثناء التصحيح المستهدفة المشبك تسجيل تجارب مع الحفاظ على المحافظة على الخلايا العصبية ممتازة، مما ييسر تحديا تطبيقات تجريبية. وترد نتائج الممثل من المشبك التصحيح متعددة الخلايا العصبية تسجيل تجارب للاعتداء أعد اتصال متشابك في الدماغ نيوكورتيكال شرائح من الشباب البالغين الفئران المحورة وراثيا وناضجة العينات الجراحة العصبية البشرية الكبار. وعلاوة على ذلك، الأسلوب الاسترداد واقية نمدج الأمثل من تشريح الدماغ متوافق مع الحيوانات الأحداث والبالغين على حد سواء، وبالتالي حل القيد من المنهجية الأصلية. وباختصار، يمكن تنفيذ وضع واحد للوسائط والدماغ التقطيع الداخلي عبر مختلف الأنواع والإعمار لتحقيق المحافظة على استمرارية والأنسجة ممتازة.

Introduction

إعداد شريحة الدماغ الحادة نظام أساسي نموذج تجريبي في علم الأعصاب. لما يقرب من نصف قرن، مكن هذا المنهاج الدراسات الفنية ديناميكية الدماغ الحية عبر طائفة واسعة من مناطق الدماغ التشريحية والأنواع الحيوانية. إذا كان التطبيق المقصود هو الكيمياء الحيوية، والتصوير الوظيفي، مورفولوجيا، أو الكهربية، من أهمية قصوى لضمان سلامة الأمثل والجدوى لشرائح الأنسجة. لهذا السبب أن إعداد شريحة الدماغ القوارض الأحداث فائقة المرونة (أي، أصغر سنا من يوم الولادة 30 للفئران) كانت الأكثر تفضيلاً للتاريخ. صعوبة الحصول على الدماغ بما فيه الكفاية صحية شرائح من بالغ ناضجة والشيخوخة الحيوانات قد ثبت أن يشكل تحديا كبيرا بالنسبة لمعظم وفرضت قيودا شديدة على دراسة الهندسة المعمارية الوظيفية للدماغ ناضجة. وهذا صحيح بصفة خاصة للتصحيح المشبك تسجيل، أسلوب الذي يتطلب الحفاظ على الخصائص المورفولوجية والوظيفية ممتازة ولا غنى عنه لوصف الخصائص الجوهرية ومتشابك مفصلة الخلايا العصبية الوحيدة التي تم تحديدها. للعقود العديدة الماضية، اعتمدت الغالبية العظمى من التصحيح المشبك اليكتروفيسيولوجيستس على أسلوب ‘قطع واقية’ استخدام استبدال السكروز منخفضة نا+ قام1 لإعداد شرائح المخ السليمة من الأحداث، وإلى حد أقل الآن مدى، الحيوانات البالغين الشباب. يقوم هذا الأسلوب على أساس أن تدفق Na+ السلبي ودخول المياه اللاحقة وخلية تورم خلال الخطوة قطع شريحة هو إهانة المهيمن الذي يؤدي إلى بقاء الفقراء من الخلايا العصبية، لا سيما لتلك الخلايا العصبية الموجودة في الطبقات السطحية التي الأكثر احتمالاً للحفاظ على الصدمة المباشرة من الحركة بليد. ومع ذلك، الأسلوب قطع واقية ما زال يترك الكثير على المستوى المطلوب لإعداد شريحة الدماغ من الحيوانات الكبار ناضجة بغض النظر عن وضع خاص قام ينفذ.

وقد تم حل هذه المشكلة بسيطة ولكن فعالة ووصف2،،من34،،من56 ووصف طريقة شريحة الدماغ ‘استعادة الحماية’. النسخة الأصلية من هذا الأسلوب يستخدم قام استبدال-نمدج، كما اعتبرت نمدج الأكثر تنوعاً والفعال بين مختلف المرشحين الصوديوم أيون البدائل الأخرى (بما فيها تريس ومادة الكولين، السكروز والجلسرين). وضع وسائل الإعلام قد عزز إضافة حبيس لمقاومة ذمة شريحة الدماغ وتوفير درجة الحموضة أقوى التخزين المؤقت7، فضلا عن إضافة المكملات الغذائية للتصدي للآثار الضارة للأكسدة (الجدول 1). تقرر تجريبيا أن حضانة انتعاش أولى خطوة في انخفاض نا+، انخفاض Ca2 +، وارتفاع Mg2 + نمدج قام فورا بعد تشريح أنسجة المخ الكبار كانت ضرورية وكافية لتحسين الخلايا العصبية الحفاظ على أكثر من مجموعة واسعة من مناطق الدماغ وأنواع الخلايا الحيوانية الإعمار3،،من56.

خاصة، ويمكن الاطلاع على التجسيد سابق لماذا الآن أطلق عليها اسم الأسلوب الاسترداد الواقية في الأدب1،،من89،10،11،12، 13، على الرغم من الإمكانات الكاملة لتنضج الكبار والشيخوخة الدماغ الحيواني تسجيل المشبك شريحة والتصحيح لم يكن يعترف أو أظهر في هذه الأعمال السابقة. وبالإضافة إلى ذلك، تواصل الاختلافات الإجرائية الدقيقة تظهر دعما لتطبيقات تجريبية محددة4،14،،من1516. الهيئة الجماعية لأعمال هذه المجموعات البحثية العديدة يضفي ثقة عالية في متانة الأسلوب الاسترداد واقية للحفاظ على النسيج محسنة. أسلوب الاسترداد واقية نمدج لديه الآن على نطاق واسع اعتمدت ونفذت في العديد من الدراسات البحثية المنشورة استخدام الدماغ الحيواني الكبار شريحة الأعمال التحضيرية. تمتد هذه الدراسات شريحة الحادة نيوكورتيكال3،،من1718،19،هيبوكامبال15،،من2021، سترياتال22 , 23 , 24و midbrain25،،من2627،،من2829و31،هيندبرين،من3032، 33 , مناطق 34 ، ومجموعة متنوعة من أنواع العصبي ونيورومودولاتور بما في ذلك جلوتاماتيرجيك4،30جابايرجيك18،،من2031،35 ،36، تتميز24،29،،من3738، اتروبين14،،من3738، 39، نورادرينيرجيك40و28 هرمون السيروتونين27،كبيرة. الأسلوب أيضا مناسبة لمراقبة نشاط الخلايا العصبية في شرائح المستمدة من الحيوانات المحورة وراثيا3،39 أو أثر في فيفو حقن الفيروسية17،27، أوبتوجينيتيك 28،40،41،،من4243، كالنحو الوظيفي وكذلك Ca2 + تصوير نشاط الخلايا العصبية2،44 ،،من4546. وكانت تحليلات قصيرة الأجل اللدونة4،،من4748 وتنوع أشكال طويلة الأجل اللدونة16،،من3548 وأفادت. دراسة أجريت مؤخرا تطبيق الأسلوب الاسترداد واقية نمدج لتيسير السبر واسعة النطاق ومنهجية الاتصال متشابك في القشرة البصرية في الماوس الكبار ناضجة الدماغ الشرائح باستخدام أوكتوباتش تسجيل التكوين49 -قوية مظاهرة من فائدة ومتانة من هذا الأسلوب. أسلوب الاسترداد الواقية حتى طبق بنجاح في السياقات التجريبية غير المتوقعة سابقا، مثل، تحسين الحفاظ على المفرج وبيريسيتيس في الدماغ القشرية الكبار شرائح50، المشبك التصحيح تسجيل من زرع السكان إينتيرنيورون في 1 – 1.5 سنة مرض الزهايمر الماوس نماذج20، والدماغ الكبار شريحة مستقبلات الاتجار مقايسة51.

البروتوكول التالي يصف إجراءات خطوة بخطوة لتنفيذ أسلوب استرداد واقية نمدج أمثل لإعداد شريحة الدماغ لتحسين جدوى شرائح الدماغ الحادة. وتناقش المبادئ لتحسين المحافظة على الخلايا العصبية، فضلا عن إثبات الفوائد الواضحة لهذه المنهجية المشبك معقدة متعددة الخلايا العصبية التصحيح تسجيل التجارب في كل من شرائح المخ الماوس المعدلة وراثيا البالغين الصغار والكبار ناضجة شرائح المخ البشري جراحة الأعصاب. قد صودق في البروتوكول التالي للفئران من 21 يوما إلى أكثر من سنة، كذلك أما بالنسبة للعينات البشرية جراحة الأعصاب المستمدة من المرضى البالغين.

Protocol

الإجراءات التي تنطوي على الفئران المعدلة وراثيا موافقة “رعاية الحيوان المؤسسية” واستخدام اللجنة (إياكوك) في معهد الين “علوم الدماغ”. واستخدمت في هذه التجارب الفئران C57BL/6 من الذكور والإناث (نطاق الوزن ز 10-30). بعض النتائج التمثيلية التي تصف البيانات التي تم جمعها من شرائح المخ البشري المعيشة. وتم الحصول على عينات الأنسجة نيوكورتيكال أثناء نيوروسورجيريس لإزالة الورم. من الضروري إزالة الأنسجة نيوكورتيكال السطحية للوصول إلى الأنسجة المريضة. تم الحصول على موافقة المريض مستنيرة في جميع الحالات لاستخدام الجراحة العصبية الأنسجة لأغراض البحث بموجب بروتوكول التي وافق عليها مجلس المراجعة المؤسساتية للمركز الطبي السويدي. 1. إعداد وسائل الإعلام والمواد الكاشفة (الجدول 1) ملاحظة: يجب أن تتألف الحلول في تنقية المياه خالية من المعادن النزرة وغيرها من الشوائب. من المستحسن إجراء الحلول الطازجة في يوم التجربة، على الرغم من أن قد يتم تخزين الحلول غير المستخدمة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد، إذا رغبت في ذلك. 1 لتر لكل صياغة أعلاه غير كافية لإجراءات تشريح 1 – 2. يجب مشبعة جميع الحلول قام كاربوجين (95% O25% CO2) قبل استخدامها التأكد من التخزين المؤقت للأس الهيدروجيني مستقرة وكافية من الأوكسجين. ينبغي تعديل درجة الحموضة من جميع الحلول إلى 7.3-7.4 و osmolality قياس وضبط إلى 300-310 موسمول/كغ. إعداد قام هيبيس نمدج (في مم): 92 نمدج، 2.5 بوكل، 1.25 NaH2بو4، 30 NaHCO3، هيبيس 20، 25 الجلوكوز، ال 2، 5 غ-اسكوربات، بيروفات غ 3 وكاكل 0.52·2H2س 104·7H مجسو2pH تيتراتي سين إلى 7.3 –7.4 مع مل 17 +/-0.5 مل حمض الهيدروكلوريك 5 أمتار.ملاحظة: ينبغي من الناحية المثالية إجراء هذه الخطوة المعايرة قبل إضافة الكاتيونات divalent لتجنب سقوط الأمطار؛ ومع ذلك، يمكن عكس هطول الأمطار عند تعديل درجة الحموضة إلى نطاق الفسيولوجية. إعداد حبيس عقد قام (مم): 92 كلوريد الصوديوم، 2.5 بوكل، 1.25 نة2بو4، 30 ناكو3، حبيس 20، 25 الجلوكوز، ال 2، 5 غ-اسكوربات، بيروفات غ 3 و 2 كاكل2·2H2س 24·7H مجسو2تيتراتي o. درجة الحموضة إلى 7.3 – 7.4 مع عدة قطرات من مركزة 10 N هيدروكسيد الصوديوم. إعداد تسجيل قام (في مم): 124 كلوريد الصوديوم، 2.5 بوكل و 1.25 نة2بو4، 24 ناكو3، الجلوكوز 12.5، حبيس 5، 2 كاكل2·2H2س و 2 مجسو4·7H2O. تيتراتي الأس الهيدروجيني إلى 7.3-7.4 مع بضع قطرات من مركزة 10 N هيدروكسيد الصوديوم. إعداد نا+ سبايك في الحل (م 2): 580 ملغ من كلوريد الصوديوم المذاب في 5 مل قام نمدج حبيس الطازجة. هذا الحل ما يكفي للإعدادية شريحة واحدة من الدماغ. إعداد [اغروس] 2% لاستخدامها لتضمين الأنسجة. حل ز 2 [اغروس] نوع 1 باء (انظر الجدول للمواد) في 100 مل 1 × برنامج تلفزيوني والميكروويف حتى مجرد الغليان. دوامة للمزيج، ثم صب الخليط في أطباق بتري معقم 10 سم والسماح لترسيخ. تخزين اللوحة [اغروس] في كيس من بلاستيك مختومة في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. إعداد حقن المخدر يعمل الحل الأسهم. خلط 2.5 g من 2,2,2-تريبروموثانول مع 5 مل من 2-الميثيل-2-butanol وثم تذوب تدريجيا في 200 مل برنامج تلفزيوني، 7.0 – 7.3 درجة الحموضة. تصفية الأسهم الحل مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر قبل استخدام وتخزين في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.ملاحظة: راجع استخدام الحيوانات كل منها اللجنة التوجيهية وقواعد لتحديد إجراءات انتهاء الصلاحية والتخلص من مخدر يعمل الحل الأسهم. 2-الإعداد لمحطة تشريح قم بإعداد محطة تشريح مع آلة تقطيع اللحم والأنسجة والأدوات الجراحية (انظر الجدول للمواد). لمعايرة آلة تقطيع اللحم، وإرفاق شفرة حاقن سيراميك زركونيوم في الذراع شفرة تستخدم غراء لاصق سريع، ثم أدخل صاحب العينة ومحاذاة الحافة الأمامية للنصل إلى حافة حامل العينة مما يترك فجوة صغيرة لضمان عدم احتكاك النصل هذا المعدن.ملاحظة: إذا كان على حافة شفرة غير معطوب جسديا فإنه يمكن إعادة استخدامها للعديد من أسابيع أو حتى أشهر بدون استبدال. نماذج مختلفة من تقطيع اللحم والأنسجة المتاحة تجارياً، وكثير منها يمكن أن توفر أداء ممتازا عند معايرة على النحو الأمثل. ينبغي أن يكون الصك المثالي انحراف محور ع الحد الأدنى، أما مباشرة قياسها وضبطها أو لوحظ تجريبيا. قم بإعداد كوب 250 مل مليئة كاربوجينيشن ثابتة (يطبق عن طريق الناشر غاز الحجر منغمسين في وسائل الإعلام) مع 200 مل قام نمدج حبيس والبرد قبل على الجليد > 10 دقيقة.ملاحظة: سيتم استخدام هذا الحل لنضح ترانسكارديال وملء خزان آلة تشريح خلال تمزيقها. إعداد قاعة الإنعاش شريحة الدماغ الأولية مليئة 150 مل قام نمدج حبيس (الحفاظ على كاربوجينيشن المستمر) والدائرة في حمام مائي ساخن الإبقاء على 32-34 درجة مئوية.ملاحظة: شريحة دائرة بعد التصميم إدواردز وكونيرث (1992) ينصح52 لهذه الخطوة. ويمكن إجراء هذه الدوائر مع الأصناف المختبرية متوفرة بسهولة (كوب 250 مل، مش النايلون في المعاوضة، 50 مل الأنبوبة المخروطية، طبق جولة البلاستيك 35 ملم). يجب الحرص على التأكد من أن الشريحة المعاوضة تظل خالية من الهواء فقاعات، خاصة تلك التي تنتجها باستمرار الحجارة فقاعة غاز كاربوجين كهذه يمكن أن يسبب شرائح تعويم أعلى وأصبح تالفاً. يجب أن تكون مغمورة المعاوضة تقريبا 1 سم تحت سطح السائل. إعداد شريحة الدماغ عقد الدائرة؛ ويوصي بتصميم مع آبار مستقلة متعددة في خزان أكبر (انظر الجدول للمواد). ملء الخزان مع 450 مل قام حبيس والحارة إلى درجة حرارة الغرفة تحت كاربوجينيشن مستمر حتى الاستخدام.ملاحظة: ستنقل شرائح الدماغ من غرفة الإنعاش الأولية إلى هذه الدائرة للتخزين طويل الأجل قبل تسجيل الكهربية. ويجب الحرص على ضمان أن يظل المعاوضة شريحة خالية من فقاعات الهواء في جميع الأوقات. إعداد المنصهر [اغروس] لتضمين الأنسجة. استخدام النهاية المفتوحة لقنينة 50 مل المخروطية مثل كوكي قاطع لقطع كتلة من 2% [اغروس] من الطبق المجهز سابقا. فضفاضة كاب القنينة مخروطية الشكل، ثم الموجات الدقيقة على 10-30 ثانية حتى مجرد ذاب [اغروس]. لا أسخن. صب [اغروس] المنصهر في أنابيب 1.5 مل. الحفاظ على [اغروس] في حالة منصهرة باستخدام ثيرموميكسير تعيين إلى 42 درجة مئوية مع الهز قوية. بعناية تضمن أن لم يصلب [اغروس] المنصهر قبل الأوان. ضع الملحق تقشعر لها اﻷبدان كتلة لمقسم طريقة العرض على الجليد لتبرد قبل هذا الوقت. 3-ترانسكارديال التروية ملاحظة: الإجراء نضح ترانسكارديال هو خطوة هامة عند العمل مع الحيوانات الكبار ومن المهم تحقيق التبريد السريع للدماغ وتباطؤ الأيض عبر ضخ الدماغ منخفضة نا+، وانخفاض Ca2 +/عالية قام Mg2 + الحل. نضح ترانسكارديال يعمل أيضا لمسح خلايا الدم الحمراء من المفرج المخ، مما يقلل من أوتوفلوريسسينسي التي قد تتداخل مع التصور واستهداف السكان الخلية المسماة فلوريسسينتلي في خطوط محوره وراثيا. فإنه لا ينصح بحذف نضح ترانسكارديال. عميق تخدير الفئران بالحقن داخل الحل الأسهم عامل مخدر (250 ملغ/كغ: 0.2 مل من 1.25% مخدر يعمل الحل الأسهم كل 10 جرام من وزن الجسم، انظر الجدول للمواد). بعد ~ 2 – 3 دقيقة، التحقق من العمق الكافي للتخدير بتقييم تو قرصه العاكسة. إذا لزم الأمر، إدخال وحدة تخزين إضافية من مخدر العامل المخزون وإعادة تقييم منعكس قرصه إصبع القدم بعد آخر 2-3 دقيقة. تحميل حقنه 30 مل مع 25 مل قام حبيس نمدج كاربوجيناتيد من الكأس المثلجة قبل 250 مل (2 – 4 درجة مئوية الأمثل، بدلاً من حل ذائب أو المجمدة). إرفاق إبرة قياس 25 5/8. باستخدام الماوس على ظهرها، دبوس أسفل فوريباوس وآثار أقدام هند للاستقرار. زجاج 15 سم طبق بيتري مليئة سيليكون تصلب يعمل أيضا كالقاعدة. استخدام مشرط، جعل شق جانبية لفتح تجويف الصدر على مستوى الحجاب الحاجز. استخدام مقص جيد لقطع طريق القفص الصدري على أما الجانب مع الحرص على تجنب القطع في القلب والرئتين. دبوس مرة أخرى مركز جزء من القفص الصدري لفضح القلب. أدخل إبرة المحاقن 30 مل في البطين الأيسر وقطع الاذين الأيمن مع مقص جيد للسماح للدم الخروج من القلب. خفض المكبس حقنه باستخدام الضغط المستمر اليدوي ونتخلل الحيوان مع قام هيبيس نمدج مبردة بمعدل ~ 10 مل/دقيقة.ملاحظة: في حالة التروية نجاح سيتم تغيير الكبد في لون من الأحمر العميق إلى أصفر باهت، وفي بعض الحالات واضحة يمكن ملاحظتها السوائل تخرج الخياشيم نهاية الإجراء. 4-الدماغ تشريح وتقطيع قطع رأس الحيوان. استخدام مشرط لفتح الجلد على رأسه، وكشف غطاء الجمجمة. قطع عظمى غرامة استخدام المقص لقطع الجلد بعيداً فوق سقف الجمجمة وجعل شقوق صغيرة أفقياً على جانبي في والذيلية/البطني قاعدة الجمجمة. جعل التخفيضات الضحلة إضافية بدءاً من الجانب الظهرية والذيلية/الجمجمة تتحرك في الاتجاه روسترال حتى خط الوسط الظهرية مع الحرص على عدم تلف الدماغ الكامنة. جعل نهائي ‘ر’ قطع خط عمودي على خط الوسط على مستوى المصابيح شمي.ملاحظة: يجب أن يكون الحرص على ضمان لا ضرر إلى region(s) الدماغ للفائدة. على وجه الخصوص، في أي وقت من الأوقات ينبغي أن يكون هناك أي قوة ضاغطة المطبقة في الدماغ نفسه. استخدام الملقط الجولة-نصيحة لفهم الجمجمة بدءاً من الجانب الآنسي روسترال وقشر مرة أخرى نحو الاتجاه الأفقي والذيلية. تكرار لكلا الجانبين للقضاء فتح وإزالة النصفين الظهرية سقف الجمجمة لفضح الدماغ. يستخرج الدماغ سليمة في الكأس ليبرد قبل حبيس نمدج قام بلطف. تسمح للدماغ شكل موحد باردة لمدة دقيقة ~ 1. استخدام ملعقة كبيرة لرفع الدماغ الخروج من الكأس وعلى طبق بيتري مغطاة بورق الترشيح. تقليم وكتلة الدماغ وفقا لزاوية المفضل لتقطيع ومنطقة الدماغ للفائدة المرجوة. العمل بسرعة لتجنب الحرمان من الأكسجين المطول أثناء المناولة.ملاحظة: العديد من زوايا تشريح الممكنة. زاوية الأسلوب وتقطيع حظر الدقيق سيتوقف على المنطقة الدماغ الدقيقة، ونوع الخلية، والدائرة دراستها. إلصاق كتلة الدماغ لصاحب العينة باستخدام غراء لاصق. سحب القطعة الداخلية لصاحب العينة ما يكفي الانسحاب الكامل داخل كتلة الدماغ. صب [اغروس] المنصهر مباشرة في الحامل حتى كتلة الدماغ مغطى تغطية كاملة في [اغروس]. المشبك التبعي يبرد قبل تقشعر لها اﻷبدان كتلة حول صاحب العينة ل ~ 10 ق حتى قد توطد [اغروس]. إدراج صاحب العينة في الوعاء على آلة تقطيع اللحم والتحقق من المحاذاة المناسبة. ملء الخزان مع المتبقية قبل برود، اﻷوكسيجين قام هيبيس نمدج من كوب 250 مل ونقل حجر فقاعة إلى الخزان خلال مدة من تشريح لضمان الأوكسجين الكافي. ضبط الميكرومتر البدء بالنهوض بالعينة جزءا لا يتجزأ من [اغروس] الدماغ. نبدأ تقطيع اللحم وتجريبيا ضبط وتيرة السرعة والتذبذب مقدما إلى المستوى المطلوب.ملاحظة: ينبغي أن يكون كلا الإعدادات في النطاق منخفض. للحصول على أفضل النتائج، تمرير واحد من الذراع شفرة ينبغي اتخاذ ما يقرب من 20 ق بالتذبذب يجب أن تنتج ضوضاء طنين سلس ولطيف جداً مع لا يعج العلني. مواصلة التقدم وتشريح الأنسجة في 300 ميكرون زيادات (أو أخرى سمك المفضل) حتى منطقة الدماغ للاهتمام هو مقطوع تماما؛ ينبغي أن يكون إجمالي الوقت لإجراء تشريح أقل من 15 دقيقة. 5. الأمثل إجراء الاسترداد واقية نمدج خطوة أولية لاسترداد نمدج (الخطوة الحرجة): بعد انتهاء عملية تقطيع، جمع كافة الشرائح باستخدام t أنابيب بلاستيكية وقف إنتاج المواد الانشطارية باستور ونقلها إلى غرفة إنعاش أولية قبل حرارة (34 درجة مئوية) مليئة 150 مل من قام نمدج حبيس. نقل جميع الشرائح في خلافة قصيرة وبدء تشغيل جهاز ضبط وقت بمجرد أن يتم نقل جميع الشرائح إلى غرفة الإنعاش. راجع الجدول 2 لتحديد نا+ الأمثل سبايك في الجدول الزمني وفقا للعمر الماوس.ملاحظة: هذا الإجراء هو طريقة عملية لتحقيق معدل إعادة إدراج نا+ في قاعة شريحة الدماغ التي تسيطر عليها، وهو الأمثل للمخ محددة شريحة دائرة الهندسة وخزان حجم ونوع (انظر الجدول للمواد). تنفيذ نا+ التدرجي سبايك في الإجراء بإضافة أحجام نا+ سبايك في الحل المشار إليه في أشير مرات. إضافة غ+ سبايك في الحل مباشرة في مدخنة bubbler غرفة الإنعاش الأولية لتسهيل الخلط السريع. نقل جميع الشرائح إلى الدائرة عقد طويل الأجل حبيس قام الحفاظ على درجة حرارة الغرفة. السماح للشرائح لاسترداد ح 1 إضافية في حبيس عقد الدائرة قبل بدء التصحيح المشبك تسجيل التجارب. 6-تصحيح المشبك التسجيل ملاحظة: الإجراءات الأساسية التالية مجرد تقديم بعض الاعتبارات العملية ولا يقصد أن تمثل بروتوكولات مفصلة لتسجيلات المشبك التصحيح، كهذه يمكن أن تكون موجودة في أماكن أخرى53،54. منصة الكهربية المشبك تصحيح مطلوب لهذا التطبيق. هذا سوف يتألف عموما مجهر تستقيم مزودة ببصريات التباين (الأشعة تحت الحمراء-DIC) التدخل التفاضلية الأشعة تحت الحمراء ونظام إضاءة فلورية، تصحيح المشبك مكبر للصوت والبيانات جهاز الالتقاط الرقمي، يجهز ميكرومانيبولاتور والمجهر منصة والجدول عزل الاهتزازات وقفص فاراداي ونظام التدفئة ونضح الحل. وينبغي تصميم نموذج الدائرة ومنصة لتسجيل شريحة المغمورة. لتسجيلات المشبك التصحيح متعددة الخلايا العصبية، مطلوب منصة مجهزة بمكبرات الصوت متعددة ومراحل الرأس، وميكرومانيبولاتورس عالية الجودة. وبالإضافة إلى ذلك، للحصول على أفضل النتائج، منصة مجهزة 900 نانومتر الأشعة تحت الحمراء تصفية تمرير ومطابقة المكونات البصرية ينصح بشدة ضمان التصور الكافي من خلايا تقع > 50 ميكرومتر العميق في شرائح المخ. المحاذاة المناسبة للإضاءة Kӧhler مهم أيضا لرؤية واضحة. إعداد الحل الماصة داخل الخلايا (في مم): 130 كغلوكونات، 4 10 نا فوسفوكريتيني2، مجاتب 4، 0.3 غ، 0.3 عطا بوكل، حبيس 102-أنشئ، و 13.4 بيوسيتين. ضبط درجة الحموضة إلى 7.35 مع 1 م كوه و osmolality إلى 285-290 موسمول/كغ استخدام السكروز حسب الحاجة. إعداد تصحيح المشبك أقطاب من الشعيرات السميكة زجاج البورسليكات؛ مسرى المشبك التصحيح المثالي له تفتق قصير نسبيا وقصير مع ~ 3 – 6 شغل موهم المقاومة نصيحة في الحمام. التأكد من وجود أسلاك الفضة الكهربائي تشلوريديد بشكل صحيح بغية ضمان تسجيلات مستقرة. القيام بذلك (بشكل نموذجي) بغمر آخر 3-4 مم الفضة الأسلاك في سائل التبييض لمدة حوالي 30 دقيقة أو حتى يتحول السلك الأسود. إنشاء نضح الحل باستخدام مضخة تمعجية تعيين إلى 3-4 مل/دقيقة كاربوجيناتيد تعميم تسجيل قام من خلال دائرة التسجيل مع الحرص على تطابق تدفق وتدفق لتجنب تجاوز السعة. نقل شريحة الدماغ واحدة في قاعة تسجيل غمر وآمنة في مكانها باستخدام رابط شريحة على شكل U بالنايلون عبر السلاسل. تحديد منطقة الدماغ الهدف استخدام هدفا جوية X 4 قبل أن ينتقل إلى هدف سلطة العليا (مثلاً، ارتفاع الفتحة العددية 40 X أو 60 X الماء الغمر الأهداف). تحديد خلية مستهدفة صحية بصريا. ظهور غشاء الخلايا العصبية في سوما، كما تصور بالأشعة تحت الحمراء-DIC مجهرية، يستخدم للحكم على مدى ملاءمة خلية مرشح لتسجيل المشبك التصحيح.ملاحظة: الخلايا العصبية صحية عادة ما يحمل الميزات التالية: لا تقلصت أو تورم سوماتى، والتباين لينة حواف الغشاء، ومظهر غشاء السلس. وبالإضافة إلى ذلك، توجد الأغلبية خلايا صحية > 30 ميكرومتر العميقة في الشريحة، حيث من المحتمل أن يكون تالفاً مع الخلايا العصبية سطحية قطعت عمليات الجذعية. وينبغي تجنب الخلايا العصبية التي يحمل مظهر المموج، نويات واضحة للعيان، أو ‘المقلية البيض’ مظهر حواف غشاء داكنة جداً أو عالية التباين. تعبئة الخلفية التصحيح “الماصة؛” مع ~ 5 ميليلتر من حل داخل الخلايا وتحميلها على حامل قطب كهربائي. الانتقال الماصة إلى حمام التسجيل أعلاه شريحة الدماغ، وتطبيق الضغط الإيجابي الخفيف لإزالة أي عوائق في التلميح. صفر الإزاحة ماصة، ورصد مقاومة تلميح باستخدام دالة اختبار غشاء. نقل تلميح ماصة اتصال مع الخلية الجسم العصبية المستهدفة في؛ ينبغي أن تشكل نقرة صغيرة على سطح الغشاء بسبب الضغط الإيجابي الخفيفة. حالما يحتفل نقرة غشاء، سرعة إزالة الضغط الإيجابي وتطبيق الشفط لطيف لتسهيل تشكيل الختم. متى يزيد المقاومة ماصة > 100 موهم، قم بتشغيل أمر عقد إلى مستوى الذي يطابق الغشاء يستريح المتوقعة المحتملة لنوع الخلية المستهدفة (-70 أم نقطة انطلاق جيدة). حالما تصل المقاومة تلميح إلى جيجاوهم إيه وان، محاولة لاقتحام الخلية بتمزيق الغشاء تحت الماصة التصحيح باستخدام نوبات قصيرة من شفط حادة؛ يمكن استخدام ميزة ‘زاب’ لتسهيل عملية الاقتحام حسب الحاجة.ملاحظة: احتمال عقد من-70 mV المقترح للجهد المشبك التجارب على الخلايا العصبية القشرية. الخلايا العصبية سليمة سيكون تسرب الحالية لا أكثر سلبية من السلطة الفلسطينية-100 طوال فترة التجربة، ولكن هذا يتوقف جزئيا على نوع الخلية. خلية ستستبعد من التحليل إذا كانت إمكانات غشاء يستريح depolarized أكثر من-50 بالسيارات، أو إذا تغيرت المقاومة الوصول بأكثر من 20%. حالما يتم الحصول على تسجيل المشبك مستقرة كامل الخلية تصحيح، استهداف الخلايا العصبية إضافية للتسجيل عن طريق تكرار الخطوات 6.6 – 6.10. الحرص على تجنب الاضطرابات الميكانيكية التي سيؤدي إلى فقدان أول تسجيل. حدد الخلايا العصبية إضافية ضمن 100 ميكرون من العصبية أولاً التأكد من وجود احتمال معقول العثور على الخلايا العصبية إلى جانب سينابتيكالي.ملاحظة: قد يكون من المفيد في بعض الحالات تحديد متعددة الخلايا العصبية المرشح مقدما وإلى مرحلة ما قبل الحمل وقبل وضع جميع الماصات القريبة إلى الخلايا المستهدفة المختلفة قبل تأسيس أول تسجيل المشبك التصحيح.

Representative Results

يوفر هذا القسم نتائج تمثيلية لإعداد شريحة الدماغ الروتينية وتصحيح التجارب الكهربية المشبك استخدام أسلوب الاسترداد واقية نمدج الأمثل (أي، وانتعاش الحمائية نمدج جنبا إلى جنب مع نا التدريجي+ سبايك في الإجراء). تم تقييم الحفاظ عليها أولاً، المورفولوجية للخلايا العصبية في مختلف مناطق الدماغ من شرائح المخ أعد مع أو بدون تنفيذ الأسلوب الاسترداد واقية نمدج الأمثل (الشكل 1). واختيرت ثلاثة أشهر القديمة الفئران الكبار لهذه التجارب، واستخدمنا الميكروسكوب DIC الأشعة تحت الحمراء لتحديد صحة الخلايا العصبية على أساس الشكل والمظهر العام سوماتى والدانية dendrites. لاحظ مظهر متنكرزه شريفيليد، معظم الخلايا العصبية في الصور التمثيلية من شرائح المخ أعدت دون أسلوب الاسترداد واقية (جميع الصور تم الحصول على ح 1 – 2 بعد إعداد شريحة). هذه الشرائح التحكم أعدت استخدام قام نمدج لنضح ترانسكارديال وتقطيع الخطوات لكن عثر في البداية في نا عالية+-تتضمن قام هيبيس. وفي المقابل، تكشف الصور التمثيلية من الشرائح المعدة باستخدام أسلوب الاسترداد واقية نمدج الأمثل الخلايا العصبية مع مورفولوجيس محسنة (أكثر سلاسة، أكمل، أقل المظهر المموج) التي مناسبة لتصحيح المشبك تسجيل (الشكل 1). ولوحظ تحسن المحافظة على الخلايا العصبية عبر مناطق متعددة في المخ بما في ذلك نيوكورتيكال طبقات الثاني/الثالث والخامس، سوبيكولوم، ونواة الظهرية يتناول الأفقي (دلجن). بعد ذلك، كان مقارنة نمدج انتعاش الحمائية الأسلوب الأمثل مع أسلوب الاسترداد واقية نمدج الأصلية (أيدون غ+ التدريجي سبايك في الإجراء). متوسط الوقت لتشكيل الختم جيجاوهم في المشبك التصحيح تسجيل محاولات انخفض بشكل كبير وإلى حد كبير (9.9 s مقابل 33.3 s، * *ف < إقران 0.005، تي-اختبار) متى تم تطبيق نا+ التدريجي سبايك في الإجراء جنبا إلى جنب مع خطوة الانتعاش واقية نمدج (الشكل 2). الغشاء أسرع وأكثر موثوقية الختم مرات إلى حد كبير تحسين إنتاجية المشبك التصحيح تسجيل شرائح المخ البالغين الشباب. نا+ الأمثل سبايك في الجدول الزمني كذلك تعديل وفقا للعمر الحيوانية (الجدول 2)، وكانت مفيدة لجميع الإعمار اختبار (3 أسابيع للفئران 1 سنة من العمر). التشكيل الجانبي لارتفاع تركيز أيون الصوديوم تدريجيا طوال فترة الإجراءات سبايك في تقدم (الشكل 3) لمرافقة الجداول المبينة في الجدول 2. كجزء من “البرنامج أنواع خلية معهد ألن” (http://celltypes.brain-map.org/) جهدا واسع نطاق يجري لمنهجية توصيف الخصائص الجوهرية الكهربية للخلايا العصبية الفردية في الشباب البالغين (40-80 يوما بعد الولادة) الفأرة البصرية الدماغ القشرية شرائح المستمدة من خطوط المحورة وراثيا مع الخلية علامة نيون الخاصة بنوع التعبير في السكان الخلايا العصبية المحددة وراثيا (الطبقة القشرية ونوع خلية محددة Cre السائق خطوط عبروا إلى الفلورسنت تعتمد على لجنة المساواة العرقية مراسل خط55). ويبين الشكل 4 آثار مثال لأنماط إطلاق النار سجلت من بارفالبومين (بفالب)-الإعراب عن القشرية التشويك سريعة (خ) إينتيرنيورونس (بفالب-آيريس–Cre/Ai14 الفئران) ردا على سلسلة من 1 s حقن الخطوات الحالية التي تغطي النطاق الديناميكي إطلاق العصبية. و–أنا منحنى ليظهر dataset من 22 إينتيرنيورونس خ القشرية في الحق. مماثلة تستهدف تصحيح المشبك تسجيل تجارب أجريت لتوصيف 23 معربا عن رورب ضادات من الخلايا العصبية في الطبقة الرابعة من الفئران رورب-آيريس–Cre/Ai14 (الشكل 4). أنواع الخلايا العصبية صحية متنوعة بما في ذلك خ إينتيرنيورونس والخلايا العصبية الهرمية عبر المناطق القشرية وطبقات يمكن بشكل روتيني وبشكل موثوق استهداف للتصحيح المشبك تسجيل على الأقل 6-8 ح بعد الأمثل إعداد شريحة باستخدام هذا البروتوكول. بالإضافة إلى قياس خصائص الخلايا العصبية الذاتية، كان سبر متشابك الاتصال بين الخلايا العصبية في وقت واحد مسجل متعددة من الأنواع المعرفة في رقائق القشرية البصرية. المشبك التصحيح متعددة الخلايا العصبية تسجيل تقنية استثنائية وتطالب، كما يجب أن تكون موجودة داخل حقل صغير نسبيا من شريحة الدماغ الخلايا العصبية المرشح صحية عديدة من الأنواع المعرفة بغية ضمان فرصة معقولة للحصول على جودة عالية التسجيلات المتزامنة وتحديد اتصالات متشابك حسن النية . يبين الشكل 5 التسجيل المقترنة من خ إينتيرنيورونس تدتوماتو + اثنين في القشرة البصرية من شرائح المخ المستمدة من الفئران بفالب-إيريس-Cre/Ai14 البالغين الشباب. تم الكشف عن اتصال متشابك مثبطة أحادي الاتجاه قوي (سجلت مع الحل ماصة الداخلية كلوريد عالية). يتم عرض مثال التسجيلات وبروتوكولات لقياس خصائص اللدونة متشابك قصيرة الأجل. نوبات تحفيز القطار عالية التردد (10 نبضات كل في 10 و 50 و 100 هرتز) وقد أعقب البقول اختبار استعادة واحدة في فترات زمنية مختلفة (1 أو 2 أو 4 s) لقياس مسار الوقت للتعافي من الاكتئاب متشابك. كما حصل النجاح الممتاز للخلايا العصبية نيوكورتيكال البشرية الناضجة الكبار السابقين فيفو شرائح المخ. يتم الحصول على عينات من الجراحة العصبية من المرضى الذين يخضعون للعمليات الجراحية المقررة لإزالة ورم في المستشفيات المحلية. إجراءات إعداد شريحة جمع والدماغ الأنسجة جراحة الأعصاب البشرية تختلف عن إجراءات الماوس شريحة الدماغ في عدد قليل من الطرق العملية. باختصار، الأنسجة نيوكورتيكال ريسيكتيد (القاصي إلى الموقع لعلم الأمراض) هو جمعت من غرفة العمليات ومنغمسين في المثلج قام هيبيس نمدج اﻷوكسيجين ونقلها مع تقشعر لها اﻷبدان مستمرة والأوكسجين من غرفة العمليات المختبر في غضون 30 دقيقة أو أقل. أعدت باستخدام إجراء الاسترداد واقية نمدج شرائح الدماغ ويسمح باسترداد لتمديد وقت لما يقرب من 3 ح قبل بدء التصحيح تسجيلات المشبك. ويبين الشكل 6 ناجحة إقران تسجيل التجربة وتجربة ناجحة رباعية تصحيح تسجيل المشبك من شرائح المخ البشري السابقين فيفو أعد بهذه الطريقة من منطقة القشرة الأمامية. التسجيل المقترنة يوضح مدخلات متشابك ضادات أحادي الاتجاه من خلية الهرمية القشرية على إينتيرنيورون القشرية (مسجلة كالتيارات بوستسينابتيك ضادات). في التصحيح رباعية تجربة اثنين عليه واثنين من الخلايا العصبية المثبطة وسجلت في نفس الوقت، وتم اكتشاف ثلاثة اتصالات متشابك المثبطة (مسجلة إمكانات بوستسينابتيك المثبطة) من أصل اثني عشر اتصالات مجموع سبر. وهكذا، تسمح هذه المنهجية شريحة الدماغ الأمثل النجاح تجريبية يمكن الاعتماد عليها في أصعب من الدماغ تطبيقات الشريحة، بما في ذلك تجارب المشبك التصحيح متعددة الخلايا العصبية لدراسة الربط الدائرة في حدة مستأصل ناضجة الكبار الدماغ البشري الأنسجة. رقم 1: تحسين المحافظة على الخلايا العصبية مع أسلوب الاسترداد واقية نمدج الأمثل لإعداد شريحة الدماغ. الممثل الأشعة تحت الحمراء-DIC الصور تم الحصول عليها من مناطق الدماغ المتنوعة في شرائح الحادة من ماوس ثلاثة أشهر. التحكم أسلوب قطع واقية نمدج دون خطوة انتعاش واقية (لوحات اليسار) مقابل أسلوب استرداد واقية نمدج الأمثل (لوحات الحق). (أ) “طبقة الخامس” من اللحاء الجديد، (ب) طبقة الثاني/الثالث من اللحاء الجديد وسوبيكولوم (ج) و (د) الظهرية نواة يتناول الأفقي (دلجن). أشرطة مقياس في كل اللوحات هي 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 2: سرعة السريع وتحسين موثوقية جيجاوهم ختم تشكيل في المشبك التصحيح تسجيل تجارب باستخدام أسلوب الاسترداد واقية نمدج مع إجراءات سبايك نا+ – الأرض (A) لتشكيل الختم جيجاوهم مرات لاسترداد نمدج وحدها (الأسود نقاط البيانات، n = 19) مقابل استرداد نمدج بالإضافة إلى إجراءات سبايك نا+ (نقاط البيانات الحمراء، n = 23). وكانت الزنزانات مسجل جميع الخلايا العصبية الهرمية في طبقة الثاني/الثالث أو الخامس من القشرة البصرية. ملاحظة، هو توج الوقت القصوى 100 s لحساب الخلايا التي شكلت الأختام جيجاوهم ابدأ. إقران تي-اختبار، * *ف < 0.005. قطعة (ب) يستريح غشاء المحتملة (خطة إدارة المبردات) للخلايا العصبية الهرمية طبقة الخامس (نقاط البيانات البرتقال، ن = 10/11)، الخلايا العصبية الهرمية الثاني/الثالث (الأخضر نقاط البيانات، ن = 9/10)، أو القشرية بفالب + “خ” إينتيرنيورونس (الأزرق نقاط البيانات، n = 23/22). تشير إلى حالة الانتعاش نمدج دوائر صلبة وفتح دوائر نمدج الانتعاش بالإضافة إلى إجراءات سبايك نا+ . +/-وزارة شؤون المرأة يتم عرض كل نقطة بيانات ويمثل واحدة من الخلايا العصبية وكل الوسط. ليست هناك فروق كبيرة في خطط إدارة المبردات مقارنة ظروف إعداد شريحة الدماغ للخلية كل ثلاثة أنواع (إقران تي-اختبار). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3 : الشخصية لارتفاع تركيز أيون الصوديوم تدريجيا طوال فترة الإجراءات سبايك في. (أ) الأرض من ارتفاع في تركيز كلوريد الصوديوم مقابل الوقت. (ب) ارسم من مجموع تركيز كلوريد الصوديوم خارج الخلية مقابل الوقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4 : الخصائص الكهربية الجوهرية لأنواع الخلايا القشرية وراثيا تعريفها. مثال (أ) آثار إطلاق العصبية استجابة لخطوات الحقن الحالية بفالب + القشرية خ إينتيرنيورونس (اللوحة اليمنى). واستهدفت تدتوماتو + الخلايا العصبية للتسجيلات في شرائح الدماغ من الفئران بفالب-آيريس–Cre/Ai14. بيانات موجزة عن إطلاق العلاقة الحالية معدل الحقن (و–أنا منحنى) ترد في حق (ن = 22). مثال (ب) آثار إطلاق الخلايا العصبية في الرد على خطوات الحقن الحالية للإعراب عن رورب الطبقة القشرية الرابع ضادات الخلايا العصبية (اللوحة اليمنى). واستهدفت تدتوماتو + الخلايا العصبية للتسجيلات في شرائح الدماغ من الفئران رورب-آيريس–Cre/Ai14. بيانات موجزة عن إطلاق العلاقة الحالية معدل الحقن (و–أنا منحنى) ترد في حق (n = 23). يمثل كل سطر ملونة رقيقة و–أنا منحنى لخلية واحدة؛ بينما خطوط سوداء سميكة يمثل المتوسط بالنسبة لكل مجموعة +/sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 5 الرقم: قصيرة الأجل اللدونة في اتصال سينابتيكالي التعبير عن بفالب إينتيرنيورونس خ القشرية. واستخدمت التباين التدخل التفاضلية (A) وابيفلوريسسينسي لاستهداف إينتيرنيورونس خ تدتوماتو-إيجابية، وإذ تعرب عن بفالب للقشرة البصرية الأولية الماوس. لون ترميز الرسم التخطيطي الاتصال التخطيطي إظهار اتصال متشابك انفرادية بين إينتيرنيورونس اثنين. (ب) التخطيطي لتحفيز البروتوكولات المستخدمة لتقييم ديناميات القصيرة الأجل من الخلايا العصبية المتصلة سينابتيكالي. القطارات من إمكانات العمل 10 (10 و 50 و 100 هرتز) التي أثارت في العصبية presynaptic، متبوعاً بإمكانية عمل واحد (نبض اختبار الاسترداد، RTP) تسليمها مع تأخير زمني مختلف (1 و 2 و 4 s) بعد أن أنهى القطار. كل RTP لوناً مميزاً للوضوح. (ج) آثار متوسط المقابلة الانفرادية المثبطة بعد متشابك الطاقات (أويبسبس) في الخلية #2 استجابة للقطارات من إمكانات العمل التي أثارت في الخلية #1. تدرج رمادي وسعت مقياس الوقت لإظهار ترسيم القطار أويبسب. (د) يتم رسمها Normalized أويبسب ستريك كدالة لموقفهم خلال القطارات على ترددات مختلفة. الاكتئاب الصافي واضح عبر أسعار جميع المدخلات مع انتعاش كبير في أويبسب في 4 س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 6: تسجيلات المشبك التصحيح متعددة الخلايا العصبية في الإنسان الكبار جراحة الأعصاب المخ شرائح. (أ) الصور منخفضة وعالية التكبير DIC الأشعة تحت الحمراء تشير إلى موقع وهوية الخلايا العصبية المسجلة (لوحات أعلى). وسجلت في نفس الوقت العصبية الهرمية (النجمة السوداء) والمجاورة إينتيرنيورون (النجمة الحمراء). مثال اللون ترميز آثار اتصال متشابك ضادات أحادي الاتجاه (اسبك) من الخلايا الهرمية إينتيرنيورون (تقاس ابسكس في الجهد المشبك) وخريطة الاتصال الفعلي المطابق (الألواح السفلي). (ب) تصحيح رباعية المشبك تسجيل التجربة في شريحة الكبار دماغ البشري جراحة الأعصاب قشرة dorsolateral prefrontal. الخلايا العصبية الهرمية اثنين وهما إينتيرنيورونس تسجل في وقت واحد، مما يسمح لسبر متسلسلة اثنا عشر الاتصالات متشابك الممكنة. قطار من مقولة إمكانات العمل في الخلية #3 (آثار الخضراء) أدت إلى الكشف عن إمكانات بعد متشابك المثبطة (إيبسبس) في كل من الأخرى ثلاثة في وقت واحد مسجل الخلايا العصبية (ثلاث مناطق محاصر، ولوحات العلوي). الردود التي سجلت من كل الخلايا العصبية الفردية لوناً مميزاً للوضوح. خريطة الاتصال الفعلي يظهر في أسفل اللوحة. ملاحظة آثار الخام سيظهر في (ب) تمثل المتوسطات للاحتلالات 20 على الأقل من البيانات الخام على التوالي. تحديد نوع الخلية المفترضة تستند إلى الشكل سوما، تحليلاً مورفولوجيا بصبغة الفلورسنت ملء خلال التسجيلات، والخصائص الكهربية الجوهرية بما في ذلك أنماط إطلاق النار ردا على خطوات الحقن الحالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- قام حبيس نمدج قام عقد هيبيس تسجيل قام المكون مم ميغاواط ز/لتر مم ميغاواط ز/لتر مم ميغاواط ز/لتر نمدج 92 195.22 17.96 قائمة توافق الأجهزة 92 36.46 * كلوريد الصوديوم 92 58.44 5.38 124 58.44 7.25 بوكل 2.5 74.55 0.19 2.5 74.55 0.19 2.5 74.55 0.19 نة2بو4 1.2 138.00 0.17 1.2 138.00 0.17 1.2 138.00 0.17 ناكو3 30 84.01 2.52 30 84.01 2.52 24 84.01 2.02 حبيس 20 238.31 4.77 20 238.31 4.77 5 238.31 1.19 الجلوكوز 25 180.20 4.51 25 180.20 4.51 12.5 180.20 2.25 اسكوربات الصوديوم 5 198.00 0.99 5 198.00 0.99 0 198.00 0.00 ال 2 76.12 0.15 2 76.12 0.15 0 76.12 0.00 بيروفات صوديوم 3 110.04 0.33 3 110.04 0.33 0 110.04 0.00 .7H مجسو42س 10 246.48 5 مل 2 246.48 1 مل 2 246.48 1 مل (الأوراق المالية م 2) كاكل2.2H2س 0.5 147.01 0.25 مل 2 147.01 1 مل 2 147.01 1 مل (الأوراق المالية م 2) * تيتراتي على درجة حموضة قام حبيس نمدج إلى 7.3-7.4 استخدام HCl مركزة ينبغي أن تكون كافة الحلول في نطاق 300-310 موسم/كغ الجدول 1: تركيبات وسائط الإعلام- عمر الحيوان الوقت (دقيقة) * < 1 شهر 1-3 أشهر 3–6 أشهر 6-12 شهرا 12 + شهرا 0 250 ميليلتر 250 ميليلتر 1 2 250 ميليلتر 3 4 500 ميليلتر 5 250 ميليلتر 250 ميليلتر 6 1000 ميليلتر 7 8 ميليلتر 2000 9 10 نقل 500 ميليلتر 250 ميليلتر 250 ميليلتر 11 12 13 14 15 1000 ميليلتر 500 ميليلتر 250 ميليلتر 250 ميليلتر 16 17 18 19 20 ميليلتر 2000 1000 ميليلتر 500 ميليلتر 250 ميليلتر 21 22 23 24 25 نقل ميليلتر 2000 1000 ميليلتر 500 ميليلتر 26 27 28 29 30 نقل 2,000 ميليلتر 1,000 ميليلتر 31 32 33 34 35 نقل 2,000 ميليلتر 36 37 38 39 40 نقل * الوقت صفر نقل الشرائح لحظة إلى غرفة الإنعاش الأولية الجدول 2: الجدول الزمني الموصى به نا التدريجي + سبايك في الإجراءات وفقا للعمر الماوس.

Discussion

نا + سبايك في يحسن تشكيل ختم جيجاوهم والمشبك التصحيح تسجيل النجاح
النسخة الأولية من أسلوب استرداد واقية نمدج صمم خصيصا للحيوانات الكبار والشيخوخة2،5. كما سعت بعض الأوائل لتطبيق هذه المنهجية على تشريح الدماغ الحيواني الأحداث (أي، الفئران < 30 يوما). ومع ذلك، لوحظ أن خلافا المعلقة أكد بصريا العصبية الحفاظ على مع أسلوب الاسترداد واقية نمدج في هذه الفئة العمرية، تشكيل ختم جيجاوهم يمكن كثيرا ما المماطلة، مما يؤدي إلى تصحيح فشل المشبك تسجيل محاولات. فرضية واحدة هي أن الكاتيونات نمدج محاصرون أكثر سهولة في شرائح المخ الأحداث بالنسبة لشرائح المخ الكبار ويمكن أن تعرقل تشكيل الختم؛ ومع ذلك، يمكن سهولة شكل الأختام جيجاوهم بينما شرائح المخ الأحداث مغمورة تماما في نمدج قام (البيانات لا تظهر)، مما يشير إلى أن نمدج قام في حد ذاته لا يعرقل تشكيل ختم جيجاوهم.

الانتقال السريع من منخفض إلى مرتفع نا+ الحل عند انتهاء الخطوة استرداد شريحة الدماغ الأولية يسبب ضررا لأغشية الخلايا العصبية وازعاجاً في عملية تشكيل الختم. هذا بديهية نظراً لأن الانتقال من منخفض إلى مرتفع نا+ودرجات الحرارة الباردة إلى الحارة وارتفاع دراماتيكية من Ca2 + Mg2 + نسبة مجتمعة تؤدي إلى تجدد نشاط متشابك عفوية ضخمة. هذه مرحلة انتعاش المثبطة في الدماغ التقطيع الداخلي من المرجح أن تعكس الإصابة ضخه بعد إهانة الدماغية. وهكذا، لمواصلة التخفيف من الضرر غشاء الخلايا العصبية في مرحلة الانتعاش الأولى نا+ تدريجي سبايك في إجراء قد أدمج فيه الارتقاء بتركيز Na+ في غرفة الحضانة انتعاش الحمائية نمدج ببطء وتكاثر مرتفعة مع التوقيت الدقيق. كما هو الحال في الإجراء الأصلي لانتعاش الحمائية، مفيد للانفصال الزماني ارتفاع نا+ من درجة الحرارة و Ca2 +/Mg2 + نسبة الارتفاع. ولكن بالإضافة إلى ذلك، نا+ سبايك في الإجراء يؤدي إلى الزيادات الإضافية الصغيرة في تركيز Na+ خارج الخلية عبر النقاط الزمنية المبكرة والزيادات الكبيرة نحو النقاط الزمنية المتأخرة، وبالتالي إتاحة أنسجة المخ الفرصة لاستيعاب أفضل لارتفاع مستويات نا+ . هذا الإجراء هو بديل لتبادل الحلول التدريجية التي تسيطر عليها مضخة نضح أو خطورة خطوط التنقيط الذي يؤدي إلى زيادة مستمرة في مستويات نا+ وتتطلب الاهتمام بتدفق وتدفق لتجنب تجاوز الدائرة شريحة. جدير بالذكر أن هذه نا+ الداخلي سبايك osmolality الحل في قاعة شريحة تدريجيا يرتفع في خلال فترة عدة دقائق قبل الشرائح يتم إرجاعه إلى حل osmolality العادي، ولكن هذا لا تؤثر سلبا على صحة شريحة أو تسجيل التصحيح المشبك النجاح. حلاً قطع osmolality عالية قد استخدمت سابقا لاستعدادات شريحة midbrain حفاظا على نحو أفضل الدوبامين من الخلايا العصبية للتصحيح المشبك تسجيلات57،58، مما يدل على أن هذا مؤقت هايبروسمولاليتي قد تكون مفيدة في بعض السياقات.

قد مددت سبايك في الخطوة الأداة المساعدة هذه المنهجية شريحة الدماغ قبل تنفيذ إجراء أمثل الجمع بين أسلوب استرداد واقية نمدج وتدريجي نا+ لتغطية الأحداث خلال العصور الحيوان الكبار ناضجة. هذا البروتوكول حدثت الآن مناسبة لمجموعة واسعة من الإعمار الحيوان باستخدام واحد وضع قام نمدج الأمثل والإجراء. إذا لزم الأمر، نا+ سبايك في الإجراءات يمكن تطبيقها مع تأخير تدريجيا أطول و/أو أبطأ بالطبع الوقت لتعزيز استمرارية شرائح المخ من كبار السن الحيوانات، وقد قدمنا دليل أساسي لجداول سبايك الموصى بها وفقا للحيوان في السن (انظر الجدول 2). وفي حين أننا قد وفر إطارا أساسيا مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات، يمكن استكشاف خطوات متقدمة إضافية لزيادة تعزيز السلامة وطول العمر من شرائح المخ من الحيوانات الكبار والشيخوخة. على سبيل المثال، الجلوتاثيون استعادة استراتيجيات فعالة بوجه خاص في هذا الصدد ويمكن تنفيذها كما هو موضح في مكان آخر2،6.

تحسين الإنتاجية للطعن في التجارب
تحليل اتصال متشابك بتسجيل التصحيح المشبك هو تطبيق تطلبا تتطلب ممتازة الحفاظ على هيكل الخلايا العصبية ووظيفة من أجل تحقيق وثوقية عالية النجاح. عدد الخلايا العصبية التي سيتم تسجيلها في نفس الوقت ترتفع خطيا، يرتفع مستوى الصعوبة التقنية أعلاه-خطيا. هناك العديد من وسائط الفشل، وواحد من الأسباب الأكثر شيوعاً لحالات الفشل هو عدم القدرة بشكل كاف جيجاوهم الأختام على واحد أو أكثر من الخلايا المستهدفة. هذا هائلة يمكن أن تبطئ التقدم، لا سيما عند ثلاثة أو يجب أن تسجل المزيد من الخلايا العصبية في وقت واحد. متسقة مع العثور على أسرع وقت تشكيل ختم جيجاوهم مع أسلوب الاسترداد واقية نمدج الأمثل، كان هناك تحسن ملحوظ في نسبة النجاح والإنتاجية من تجارب تسجيل التصحيح متعددة الخلايا العصبية المشبك مع الكبار على حد سواء المحورة وراثيا شرائح المخ الماوس والشرائح المخ الجراحة العصبية البشرية الكبار. تحسين كفاءة ويعزى يكاد يكون من المؤكد لتشكيل الختم جيجاوهم أسرع وأكثر موثوقية والحفاظ على الخلايا العصبية المحسنة للشرائح مع هذا البروتوكول. على الرغم من أن يركز هذا البروتوكول على فوائد صراحة للتصحيح المشبك تسجيل التطبيقات، يتوقع تحقيق مكاسب مماثلة للتطبيقات التجريبية الصعبة الأخرى حيث صلاحية شريحة الدماغ أمر بالغ الأهمية.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الين “علوم المخ”. الكتاب أود أن أشكر مؤسسي معهد ألن، بول غ. الين والين جودي، للرؤية والتشجيع، والدعم. ونشكر أيضا على موظفي الدعم التقني الين المعهد للقيام برعاية الحيوان وتربية والتنميط.

Materials

Compresstome VF-200 Precisionary Instruments VF-200 Vibrating tissue slicer (recommended)
N-methyl-D-glucamine Sigma Aldrich M2004 aCSF constituent
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014 aCSF constituent
Potassium Chloride Sigma Aldrich P5405 aCSF constituent
Sodium Phosphate monobasic dihydrate Sigma Aldrich 71505 aCSF constituent
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761 aCSF constituent
HEPES Sigma Aldrich H4034 aCSF constituent
Glucose Sigma Aldrich G7021 aCSF constituent
Sodium Ascorbate Sigma Aldrich A4034 aCSF constituent
Thiourea Sigma Aldrich T8656 aCSF constituent
Sodium pyruvate Sigma Aldrich P5280 aCSF constituent
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902 aCSF constituent
Magnesium Sulfate heptahydrate Sigma Aldrich M1880 aCSF constituent
2,2,2-Tribromoethanol  Sigma Aldrich T48402 Anesthetic component 1
2-methyl-2-butanol  Sigma Aldrich 240486 Anesthetic component 2
Curved blunt forceps Fine Science Tools 11065-07 Brain dissection tools
Fine dissecting scissors (supercut) Fine Science Tools 14058-09 Brain dissection tools
Large heavy duty scissors 7'' Fine Science Tools 14000-18 Brain dissection tools
Metal spatula Sigma Aldrich Z511455-1PAK Brain dissection tools
Razor blades VWR 89031-954 Brain dissection tools
Brain Slice Keeper-4 Automate Scientific S-BSK4 brain slice holding chamber
nylon netting  Warner Instruments 64-0198 For building small slice recovery chambers
Pyrex glass beakers (250 mL) VWR 89090-434 For building small slice recovery chambers
35 mm plastic dish, round VWR 100488-376 For building small slice recovery chambers
Gas diffuser stones (10 µm) Sigma Aldrich 59277 For constant carbogenation (fine bubbles)
Agarose Type I-B Sigma Aldrich A0576 For embedding brain specimens
Micro loader tips Eppendorf 22491229 For filling patch clamp electrodes
Sylgard VWR 102092-312 For making a custom dissecting platform
Hydrochloric acid  Sigma Aldrich H1758-100ML For pH adjustment of media
Sodium Hydroxide  Sigma Aldrich 221465-25G For pH adjustment of media
Potassium Hydroxide Sigma Aldrich 221473 For pH adjustment of media
Plastic transfer pipets 3 mL graduated VWR 89497-676 For slice transfer
Zirconium ceramic injector blades Cadence Specialty Blades EF-INZ10 http://cadenceinc.com/
KG-33 borosilicate glass capillary w/filament King Glass Company custom quote ID: 0.87mm, OD 1.50mm
Biocytin Sigma Aldrich B4261 Intern pipette solution
Phosphocreatine disodium Sigma Aldrich P7936 Intern pipette solution
Potassium Gluconate Sigma Aldrich G4500-100G Intern pipette solution
EGTA Sigma Aldrich E3889 Intern pipette solution
Mg-ATP Sigma Aldrich A9187 Intern pipette solution
Na2-GTP Sigma Aldrich 51120 Intern pipette solution
sucrose Sigma Aldrich S0389 Intern pipette solution
Heated water bath (2.5L) VWR 13491-060 Miscellaneous
Filter paper rounds VWR 28456-022 Miscellaneous
Cyanoacrylate glue Amazon B000BQRBO6 Miscellaneous
Glass petri dish VWR 89000-326 Miscellaneous
10X Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5493 Miscellaneous
30 mL syringes VWR BD302832 Miscellaneous
1 mL syringes VWR BD-309628 Miscellaneous
25 5/8 gauge needles VWR 89219-292 Miscellaneous
Thermomixer (w/1.5 mL tube block) VWR 89232-908 To keep agarose molten 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3 (4), 331-338 (1989).
  2. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods Mol Biol. 1183, 221-242 (2014).
  3. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  4. Peca, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  5. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals. Society for Neuroscience Abstracts. 520, (2011).
  6. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals (Part II): Glutathione depletion underlies rapid deterioration of adult brain slices. Society for Neuroscience Abstracts. 505, (2012).
  7. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neurosci Lett. 303 (3), 141-144 (2001).
  8. Liu, Y. B., Guo, J. Z., Chiappinelli, V. A. Nicotinic receptor-mediated biphasic effect on neuronal excitability in chick lateral spiriform neurons. Neuroscience. 148 (4), 1004-1014 (2007).
  9. Xiang, Z., Huguenard, J. R., Prince, D. A. GABAA receptor-mediated currents in interneurons and pyramidal cells of rat visual cortex. J Physiol. 506, 715-730 (1998).
  10. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  11. Contractor, A., et al. Loss of kainate receptor-mediated heterosynaptic facilitation of mossy-fiber synapses in KA2-/- mice. J Neurosci. 23 (2), 422-429 (2003).
  12. Pita-Almenar, J. D., Collado, M. S., Colbert, C. M., Eskin, A. Different mechanisms exist for the plasticity of glutamate reuptake during early long-term potentiation (LTP) and late LTP. J Neurosci. 26 (41), 10461-10471 (2006).
  13. Ito, K., Contractor, A., Swanson, G. T. Attenuated plasticity of postsynaptic kainate receptors in hippocampal CA3 pyramidal neurons. J Neurosci. 24 (27), 6228-6236 (2004).
  14. Van Dort, C. J., et al. Optogenetic activation of cholinergic neurons in the PPT or LDT induces REM sleep. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), 584-589 (2015).
  15. Ferando, I., Mody, I. Altered gamma oscillations during pregnancy through loss of delta subunit-containing GABA(A) receptors on parvalbumin interneurons. Front Neural Circuits. 7, 144 (2013).
  16. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  17. Takahashi, Y. K., et al. Neural estimates of imagined outcomes in the orbitofrontal cortex drive behavior and learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  18. Pan, G., et al. Preserving GABAergic interneurons in acute brain slices of mice using the N-methyl-D-glucamine-based artificial cerebrospinal fluid method. Neurosci Bull. 31 (2), 265-270 (2015).
  19. LaSarge, C. L., Santos, V. R., Danzer, S. C. PTEN deletion from adult-generated dentate granule cells disrupts granule cell mossy fiber axon structure. Neurobiol Dis. 75, 142-150 (2015).
  20. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. J Neurosci. 34 (29), 9506-9515 (2014).
  21. Fleming, R. L., et al. Binge-pattern ethanol exposure during adolescence, but not adulthood, causes persistent changes in GABAA receptor-mediated tonic inhibition in dentate granule cells. Alcohol Clin Exp Res. 37 (7), 1154-1160 (2013).
  22. Kummer, K. K., El Rawas, R., Kress, M., Saria, A., Zernig, G. Social interaction and cocaine conditioning in mice increase spontaneous spike frequency in the nucleus accumbens or septal nuclei as revealed by multielectrode array recordings. Pharmacology. 95 (1-2), 42-49 (2015).
  23. Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nat Commun. 5, 5390 (2014).
  24. Wang, L., et al. Modulation of dopamine release in the striatum by physiologically relevant levels of nicotine. Nat Commun. 5, 3925 (2014).
  25. Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. , (2015).
  26. Tucker, K. R., Huertas, M. A., Horn, J. P., Canavier, C. C., Levitan, E. S. Pacemaker rate and depolarization block in nigral dopamine neurons: a somatic sodium channel balancing act. J Neurosci. 32 (42), 14519-14531 (2012).
  27. McDevitt, R. A., et al. Serotonergic versus nonserotonergic dorsal raphe projection neurons: differential participation in reward circuitry. Cell Rep. 8 (6), 1857-1869 (2014).
  28. Wang, D. V., et al. Mesopontine median raphe regulates hippocampal ripple oscillation and memory consolidation. Nat Neurosci. 18 (5), 728-735 (2015).
  29. Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. alpha4alpha6beta2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Mol Pharmacol. 84 (3), 393-406 (2013).
  30. Vance, K. M., Ribnicky, D. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. Artemisia santolinifolia enhances glutamatergic neurotransmission in the nucleus of the solitary tract. Neurosci Lett. 582, 115-119 (2014).
  31. Dergacheva, O., Boychuk, C. R., Mendelowitz, D. Developmental changes in GABAergic neurotransmission to presympathetic and cardiac parasympathetic neurons in the brainstem. J Neurophysiol. 110 (3), 672-679 (2013).
  32. Dergacheva, O. Chronic intermittent hypoxia alters neurotransmission from lateral paragigantocellular nucleus to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. J Neurophysiol. 113 (1), 380-389 (2015).
  33. Dyavanapalli, J., et al. Chronic intermittent hypoxia-hypercapnia blunts heart rate responses and alters neurotransmission to cardiac vagal neurons. J Physiol. 592, 2799-2811 (2014).
  34. Apostolides, P. F., Trussell, L. O. Regulation of interneuron excitability by gap junction coupling with principal cells. Nat Neurosci. 16 (12), 1764-1772 (2013).
  35. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  36. Ferando, I., Mody, I. In vitro gamma oscillations following partial and complete ablation of delta subunit-containing GABAA receptors from parvalbumin interneurons. Neuropharmacology. 88, 91-98 (2015).
  37. Foster, D. J., et al. M5 receptor activation produces opposing physiological outcomes in dopamine neurons depending on the receptor’s location. J Neurosci. 34 (9), 3253-3262 (2014).
  38. Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. J Vis Exp. (68), e50034 (2012).
  39. Wang, L., et al. Temporal components of cholinergic terminal to dopaminergic terminal transmission in dorsal striatum slices of mice. J Physiol. 592, 3559-3576 (2014).
  40. Holloway, B. B., et al. Monosynaptic glutamatergic activation of locus coeruleus and other lower brainstem noradrenergic neurons by the C1 cells in mice. J Neurosci. 33 (48), 18792-18805 (2013).
  41. DePuy, S. D., et al. Glutamatergic neurotransmission between the C1 neurons and the parasympathetic preganglionic neurons of the dorsal motor nucleus of the vagus. J Neurosci. 33 (4), 1486-1497 (2013).
  42. Abbott, S. B., Holloway, B. B., Viar, K. E., Guyenet, P. G. Vesicular glutamate transporter 2 is required for the respiratory and parasympathetic activation produced by optogenetic stimulation of catecholaminergic neurons in the rostral ventrolateral medulla of mice in vivo. Eur J Neurosci. 39 (1), 98-106 (2014).
  43. Dergacheva, O., Dyavanapalli, J., Pinol, R. A., Mendelowitz, D. Chronic intermittent hypoxia and hypercapnia inhibit the hypothalamic paraventricular nucleus neurotransmission to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. Hypertension. 64 (3), 597-603 (2014).
  44. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  45. Luongo, F. H., Horn, M. E. Sohal V.S. Putative microcircuit-level substrates for attention are disrupted in mouse models of autism. Biological Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).
  46. Vance, K. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. PAR1-activated astrocytes in the nucleus of the solitary tract stimulate adjacent neurons via NMDA receptors. J Neurosci. 35 (2), 776-785 (2015).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a cooperate in the regulation of epileptic and synaptic activity in the CA1 region of the hippocampus. J Neurosci. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Tomioka, N. H., et al. Elfn1 recruits presynaptic mGluR7 in trans and its loss results in seizures. Nat Commun. 5, 4501 (2014).
  49. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 9462 (2015).
  50. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Protoc. 9 (2), 323-336 (2014).
  51. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. (86), (2014).
  52. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods Enzymol. 207, 208-222 (1992).
  53. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. J Vis Exp. (95), e52358 (2015).
  54. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
  55. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  56. Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. J Gen Physiol. 58 (6), 599-619 (1971).
  57. Martin, M., Chen, B. T., Hopf, F. W., Bowers, M. S., Bonci, A. Cocaine self-administration selectively abolishes LTD in the core of the nucleus accumbens. Nat Neurosci. 9 (7), 868-869 (2006).
  58. Chen, B. T., et al. Cocaine but not natural reward self-administration nor passive cocaine infusion produces persistent LTP in the VTA. Neuron. 59 (2), 288-297 (2008).

Tags

Brain SlicesNMDG Protective Recovery MethodPatch Clamp ElectrophysiologyNeuronal PreservationAdult Mouse BrainNMDG HEPES ACSFBrain Slice Recovery ChamberHEPES ACSFAgarose Embedding

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ting, J. T., Lee, B. R., Chong, P., Soler-Llavina, G., Cobbs, C., Koch, C., Zeng, H., Lein, E. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. J. Vis. Exp. (132), e53825, doi:10.3791/53825 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image