最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

トランスジェニック マウスを含むプロシージャは脳科学機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) アレンの協会によって承認されています。男性と女性の両方の c57bl/6 マウス (重量範囲 10-30 g) は、これらの実験で使用されました。代表的な結果のいくつかは生きている人間の脳のスライスから収集されるデータについて説明します。新皮質の組織標本は、腫瘍除去のため neurosurgeries の間に得られました。病気の組織へのアクセスを得るために上を覆う大脳新皮質組織を除去する必要があります。スウェーデンの医療センターの倫理委員会によって承認されたプロトコルの下で研究目的のため脳組織の使用のためのすべてのケースで情報に基づいた患者の同意が得られました。 1. メディアおよび試薬 (表 1) の準備 注: ソリューションは、微量金属やその他の不純物のない純水で提示しなければなりません。未使用ソリューション可能性があります保存が 4 ° C で最大 1 週間必要な場合、ソリューションで作成している新鮮な実験の日をお勧めします。上記それぞれの製剤の 1 L は 1-2 スライス手順に十分です。アプライドのすべてのソリューションは、安定した pH 緩衝と十分な酸素供給を確保するため使用する前にカーボゲン ・ (95% O25% CO2) と飽和状態になる必要があります。すべてのソリューションの pH を調整する 7.3 7.4 と浸透圧測定し、300 310 mOsmol/kg に調整。 NMDG HEPES アプライド (mM) での準備: 92 NMDG、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3、20 HEPES、25 グルコース、2 チオ尿素、5 Na ・ アスコルビン酸、ピルビン酸 Na 3-、0.5 CaCl2·2H2O、および 10 MgSO4·7H2滴定修 pH 7.35 M 塩酸 0.5 mL ± 17 mL と –7.4。理想的には注: 沈殿物; を避けるために 2価陽イオンの添加する前にこの滴定手順を実行する必要があります。ただし、降水量は生理的な範囲に pH の調整によって反転できます。 アプライド (mM) を保持 HEPES を準備: 92 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3、20 HEPES、25 グルコース、2 チオ尿素、アスコルビン酸 Na 5、3 Na ピルビン酸、2 CaCl2·2H2O 2 MgSO4·7H2滴定修pH 7.3 – 7.4 を数滴にするには、10 N NaOH が集中しています。 (MM) で記録アプライドの準備: 124 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、24 NaHCO3、12.5 グルコース、5 HEPES、2 CaCl2·2H2O 2 MgSO4·7H2O. 滴定 pH 7.3 7.4 に数滴10 N NaOH を集中しました。 Na+スパイクのソリューション (2 M) を準備: 作りたて NMDG HEPES アプライドの 5 mL に溶解した塩化ナトリウム 580 mg。一つの脳スライスの準備のため十分なソリューションです。 ティッシュを埋め込むに使用する 2% の agarose を準備します。アガロース タイプ 1 b の 2 g を溶解 (材料の表を参照してください) だけ沸騰するまで PBS、電子レンジ × 1 100 ml。渦巻き模様のミックス、滅菌 10 cm シャーレに混合物を注ぐし固化することができます。使用するまで 4 ° C で密閉されたビニール袋にアガロース ・ プレートを格納します。 注射用麻酔薬の原液を作業を準備します。2-メチル-2-ブタノールの 5 ml 2,2,2 Tribromoethanol 2.5 g を混合し、200 mL の PBS、pH 7.0-7.3 に徐々 に溶解します。0.22 μ m フィルターを使用する前に原液をフィルターし、光から保護 4 ° C で保存します。注: は、原液を使用する麻酔薬の有効期限と廃棄の手順を決定するためそれぞれの動物の使用委員会ガイドラインとルールを参照してください。 2. スライスの駅の設定 組織スライサー マシンと手術器具 (材料の表を参照してください)、スライスの駅を設定します。、スライサー マシンを調整するには、ジルコニウム セラミック インジェクター ブレードを高速接着剤接着剤を用いたブレード アームに接続し、試料ホルダーを挿入し、ブレードがこすりしないように小さなギャップを残して試料ホルダーの縁に刃の先端を揃える金属。注: 刃先が物理的に破損していない場合それ再利用できる多くの数週間あるいは数ヶ月交換せず。市販されているさまざまな組織スライサー モデル、多くの最適キャリブレーションと優れたパフォーマンスを提供できます。理想的な計測器最小 z 軸たわみ、直接測定し調整または経験的に観察が必要です。 250 mL NMDG HEPES アプライドと氷の上の前の寒さの 200 ml が入ったビーカー (メディアに没頭して石ガス ディフューザーを介して適用) 定数 carbogenation のセットアップ > 10 分。注: transcardial の灌流及び断面中にスライシング マシン貯水池を埋めるため、このソリューションは使用しています。 150 ml NMDG HEPES アプライドの初期脳スライス回復室を設定 (定数 carbogenation を維持) 32-34 ° C で維持される温水浴でチャンバーを配置し、注: デザイン後スライス室エドワーズの Konnerth (1992 年)52は、この手順をオススメです。これらの部屋は容易に利用可能な検査項目を行うことができます (250 mL ビーカー、ナイロン メッシュ網、50 mL の円錐管、35 mm のプラスチック製の丸いお皿)。ネッティング空気の無料のままスライスの泡、特に継続的にカーボゲン ・ ガス泡石プロデュースこれらはスライスをフロートし、破損を引き起こす可能性があることを確認するには、注意が必要です。網は、液体の表面の下で約 1 cm 水没する必要があります。 保持室; 脳スライスをセットアップします。大きな貯水池の複数の独立した井戸の設計をお勧めします (材料の表を参照してください)。リザーバーは使用するまで 450 ml HEPES アプライドと室温一定 carbogenation の下に暖かいの。注: 脳スライスは最初の回復室からこの商工会議所電気生理学的記録の前に長期保存のために転送されます。気泡の自由のスライス網遺跡が常時確保するため注意が必要があります。 ティッシュを埋め込むため溶融アガロースを準備します。クッキーの抜き型のような 50 mL コニカル バイアルのオープン エンドを使用して、事前に準備された皿から 2% の agarose のブロックをカットします。緩く円錐バイアルのキャップ、10-30 s agarose が丁度溶けるまで電子レンジします。過熱しません。 溶融アガロースを 1.5 mL チューブに注ぐ。活発な動揺で 42 ° C に設定 thermomixer を使用して溶融状態でアガロースを維持します。慎重に溶融 agarose が途中で凝固しないことを確認します。 この時点であらかじめ冷たい氷のスライサーのブロックを低温アクセサリーを配置します。 3. Transcardial 潅流 注: transcardial 潅流プロシージャ大人動物を操作するときの重要なステップし脳の急速な冷却を達成することが重要で、低 Na+の脳注入を介して代謝を減速、低 Ca2 +/高 Mg2 +アプライドソリューションです。Transcardial 血流も蛍光可視化と形質転換線の蛍光に分類された細胞集団のターゲットに干渉する可能性を軽減する脳血管から赤血球をオフに提供しています。Transcardial 血流を省略することはお勧めできません。 深く麻酔作業原液腹腔内投与によるマウスの麻酔 (250 mg/kg: 0.2 mL 1.25% の麻酔薬 10 g 体重当たり原液を作業テーブルの材料を参照してください)。後 ~ 2-3 分、つま先ピンチ反射を評価することによって十分な麻酔深度を確認します。必要に応じて、追加麻酔在庫量を注入し、別の 2 〜 3 分後つま先ピンチ反射を再評価します。 (2-4 ° C が最適、雪解けや冷凍のソリューションではなく) 中古冷蔵 250 mL ビーカーから carbogenated NMDG HEPES アプライドの 25 mL と 30 mL シリンジをロードします。25 5/8 ゲージの針を取り付けます。 その裏にマウスで、前足と後足は前足の安定をピンで止めます。15 cm ガラス シャーレは、ベースとしてよく硬化シリコーン作品に満ちています。 メスを使えば、横切開を横隔膜のレベルで胸腔内を開きます。どちら側の世話に心臓と肺をクリッピングを避けるために胸郭をカットする高級はさみを使用します。 ピン中心部を公開する胸郭の中央部分。30 mL の注射器の針を左心室に挿入し、血液が心臓を終了するように細かいハサミで右房をカットします。 手動の一定の圧力を使用してシリンジのプランジャーを押し下げるし、〜 10 mL/分の速度でチルド NMDG HEPES アプライドで動物を灌流します。メモ: 灌流が成功した場合は、深い赤色から淡い黄色に色およびプロシージャの終わりに向かって鼻を終了する流体を観測できる明確ないくつかのケースで肝臓が変更します。 4. 脳の解剖とスライス 動物の首をはねます。メスを使用して頭部の皮膚を開き、スカル キャップを公開します。 使用罰金スーパー カットはさみスカル キャップの上の皮膚を切り取るし、小切開横尾/腹の両側にスカルの基本に。基になる脳を損傷しないように注意を取って背側正中線上を吻側方向に動いてスカルの尾側/背側側面から始まるその他の浅いカットを作る。最終的な ‘T を作る’ 嗅球のレベルで正中線に垂直をカットします。注: 興味の脳領域への損傷が行われないように注意する必要があります。特に、時間がない時あります脳自体に適用される圧縮の力がかかります。 吻側内側面から頭蓋骨を把握し尾側方向に向かって皮をむくラウンド先端の鉗子を使用します。クラックする両側の繰り返しを開き、脳を公開する頭蓋骨キャップの背側の半分を削除します。中古冷蔵 NMDG HEPES アプライドのビーカーに脳をそのままを優しくかき出します。〜 1 分を均一に冷却する脳を許可します。 大きなヘラを使用して、フィルターの紙で覆われてペトリ皿にビーカーから脳を持ち上げます。トリムし、スライスの好みの角度によると脳領域を必要に応じて脳をブロックします。処理中に長時間の酸素欠乏を避けるためにすぐに動作します。注: 多くのスライス角度が可能です。正確なブロッキング メソッドとスライス角度は調査されるべき正確な脳の領域、細胞型、および回路が異なります。 接着剤を使用して試料ホルダーに頭脳のブロックに貼付します。十分な脳ブロックの完全に内側を撤回する試料ホルダーの内側部分を撤回します。脳ブロックが agarose で完全に覆われるまでは、ホルダーに直接溶融アガロースを注ぐ。〜 10 用試料ホルダーの周囲にブロックを低温予冷アクセサリー クランプ s agarose が固化するまで。 試料ホルダーをスライサー マシンのソケットに挿入し、適切なアライメントを確認します。リザーバーは 250 mL のビーカーから残り中古冷蔵、酸素 NMDG HEPES アプライド、貯水池に十分な酸素を確保するためのスライスの間バブル石を移動します。 アガロース埋め込み脳標本を前進を開始するマイクロ メーターを調整します。スライサーを開始し、経験的希望のレベルまで進歩速度および発振周波数を調整します。注: 両方の設定は、低域でする必要があります。最高の結果を得るには、単一を取る約 20 s と振動する必要がありますとなりますないあからさまな賑やかで非常に滑らかで穏やかなハミング ノイズ ブレード アームの渡します。 先へ進めし、300 μ m 刻み (または他の好適な厚さ) で脳の領域まで興味のティッシュをスライスは断面が完全に;スライス手順の合計時間は、15 分未満にする必要があります。 5. NMDG 保護回復手順の最適化 初期 NMDG 回復ステップ (重要なステップ): 断面の手順が完了したら、カットオフ プラスチック パスツール パイプ t を使用してスライスのすべてを収集し、150 ml の初期回復商工会議所に予め温めておいた (34 ° C) に転送NMDG HEPES アプライド。短い連続ですべてのスライスを転送し、すべてのスライスは、回復室に移動するとすぐに、タイマーを開始します。 表 2マウスの年齢に応じて最適な Na+スパイクのスケジュールを決定するを参照してください。注: この手順は、脳スライス室に Na+の再導入速度の制御を達成するために実用的な方法 (材料表参照) 特定の脳スライス チャンバー形状と貯留層ボリュームと種類の最適化します。 ステップワイズ スパイクで Na+を実行で示された Na+スパイクでソリューションの指定されたボリュームを追加回。急速混合を容易にする最初の回復室のバブラー煙突に直接ソリューション スパイクで Na+を追加します。 すべてのスライスを室温で維持される HEPES アプライド長期保持チャンバーに転送します。保持室パッチ クランプ記録実験を開始する前に HEPES でさらに 1 時間を回復するスライスを許可します。 6. パッチ ・ クランプ記録 注: 次の基本的な手順だけいくつかの実用的な考慮事項を提供、これら見つけることができます他の場所,5354としてパッチ クランプの録音のための詳しいプロトコルを表すにはものではありません。パッチ クランプ電気生理学リグはこのアプリケーションに必要です。これ、一般的に装備されて赤外線差動干渉の対照 (IR DIC) 光学正立顕微鏡で構成されます、蛍光照明システム、パッチ クランプ アンプとデータ デジタイザー電動マイクロマニピュレーターと顕微鏡プラットフォーム、除振台、ファラデーケージの中に、ソリューションの暖房および灌流システム試料室とプラットフォームは、浸漬スライス記録を設計するべきです。多ニューロン パッチ クランプ録画、複数のアンプ、ヘッドのステージ、および高品質のマニピュレーターを装備したリグが必要です。また、最高の結果を得るには、リグは 900 nm IR バンドパス フィルターを装備、光学部品のマッチングは細胞の適切な可視化を確保するため勧め > 50 μ m 脳スライスで深い。Kӧhler 照明の適切な配置も明確に可視化のために重要です。 (MM) の細胞内ピペット ソリューションを準備: グルコン酸 K 130-4 10 クレアチンリン酸 Na2, 4 MgATP 0.3 Na, 0.3 グリコールエーテルジアミン四酢酸 10 HEPES KCl2-GTP と 13.4 biocytin。1 M コで 7.35 に pH, 285-290 mOsmol/kg 必要としてショ糖を使用して浸透圧を調整します。 ホウケイ酸ガラスの肉厚の毛細血管からパッチ クランプ電極を準備します。理想的なパッチ クランプ電極が比較的短いとずんぐりしたテーパー m ω に満ちた ~ 3-6 お風呂で先端抵抗。 銀電極ワイヤが正しく安定した録音を確保するために chlorided ことを確認します。これを行うに液体漂白剤約 30 分、またはワイヤーが黒くなるまでの最後の沈没によって (典型的な) 3-4 mm 銀のワイヤーします。 オーバーフローを避けるため蠕動性ポンプ流入と流出を合わせて世話録音室をアプライドの記録 3-4 mL/分循環 carbogenated に設定を用いた灌流を確立します。 水没記録室に単一の脳スライスを転送し、セキュリティで保護された場所にナイロンとスライスの U 字アンカーを使用して文字列をクロスします。高い電力目的 (例えば、高開口数 40 X、60 X 水浸漬の目的) に切り替える前に 4 X 空気目的を使用してターゲットの脳の領域を特定します。 健康的な標的細胞を視覚的に識別します。相馬では、神経細胞の膜の外観 IR DIC 顕微鏡による可視化は、パッチ ・ クランプ記録のセルが候補者の適合性を判断するために使用されます。注: 健康的なニューロンは通常次の機能を展示: 縮んだもいつつ、ソフト コントラスト膜エッジと滑らかな膜外観の腫れ。さらに、健康な細胞の大半がある > 30 μ m、スライスで深い表面的なニューロンで破損している可能性があると切断樹状突起。しわの外観をはっきりと見える核または ‘目玉’ の外観、または非常に暗いまたは高コントラスト膜の端を示すニューロンは避けるべきであります。 埋戻しパッチ ピペットの細胞内の溶液の ~ 5 μ L で、電極ホルダーに読み込みます。脳スライスの上記録風呂にピペットを移動し、先端に障害物を除去する光の肯定的な圧力を適用します。ピペットのオフセットをゼロし、膜のテスト機能を用いた先端抵抗を監視します。 ピペット チップ ターゲット ニューロンの細胞体との接触を移動します。光の肯定的な圧力により膜表面の小さなディンプルを形成する必要があります。 膜ディンプルを観察すると、すぐに迅速の肯定的な圧力を削除し、シール形成を容易にする穏やかな吸引を適用します。ピペットの抵抗増加に一度 > 100 m ω 型の対象となるセルの潜在的な予想される静止膜に一致するレベルに保持コマンドをオンに (-70 mV 良い出発点である)。 先端抵抗 ≥ 1 gigaohm に達すると、鋭い吸引; の簡単な発作を使用してパッチ ピペットの下にある膜を破裂してセルに侵入を試みる’攻撃’ の機能は、必要に応じて侵入を容易に利用されるかもしれない。注:-70 の開催可能性皮質ニューロンの電圧クランプ実験用 mV が示唆されました。健康的なニューロン リーク電流-100 pA よりもこれ以上負実験の期間がこれはセルの種類に一部依存。静止膜電位は-50 よりより脱分極場合解析から除外されるニューロン mV、またはアクセス抵抗が 20% 以上変更された場合。 安定の全細胞パッチ ・ クランプ記録を取得した後手順 6.6-6.10 を繰り返すことによって記録のための追加のニューロンをターゲットします。最初の記録を失うことになる機械的障害を避けるために注意してください。 ニューロンのシナプス結合を見つけることの合理的な確率を確保するための最初の神経細胞から 100 μ m 内にある追加のニューロンを選択します。メモ: 前もって複数の候補者のニューロンを識別するために、事前読み込みし、最初のパッチク ランプ記録を確立する前に様々 な標的細胞に近くすべてピペットを事前位置にいくつかのケースで役に立つ場合があります。