Herstellung von Ratten Oligodendrozyten Vorläuferkulturen und Quantifizierung von Oligodendrogenesis Mit Doppel-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning

Efficient Nervenleitung in der Säugetiere Zentralnervensystem (ZNS) erfordert Myelinisierung von Axonen durch Oligodendrozyten. Während der Entwicklung entstehen Oligodendrozyten aus einem Pool von Oligodendrozyten-Progenitorzellen (OPC), die gedacht werden, von den ventrikulären Zonen der Entwicklung des Vorderhirns und Neuralrohr ¹ zu migrieren. Nach der Migration OPCs zu reifen unterscheiden, myelinisierenden Oligodendrozyten, die nicht nur effizient Impulsausbreitung zu erleichtern, sondern auch Axone mit trophischen Unterstützung ² liefern. Die adulten ZNS unterhält eine reichliche Population von OPCs, die während der grauen und weißen Substanz dispergiert sind, die ungefähr 5-8% aller Zellen ^3. Nach einer demyelinisierenden Beleidigung, wandern OPCs zu der Stelle der Verletzung, vermehren und differenzieren verlorenen oder beschädigten Myelinscheiden an exponierten Axone zu ersetzen. Doch in einigen Krankheit / Verletzung Einstellungen wird dieses Verfahren ineffizient zu sein oder ganz ausfallen ⁴ gefunden. Währendchronische Demyelinisierung wird gedacht, um die Krankheitslast, effiziente oligodendrogenesis und Remyelinisierung kostenlos in ^fünf Symptome zu lindern. Es ist daher von Interesse gewesen OPCs in vitro zu studieren die Wirkung der experimentellen Faktoren auf oligodendrogenesis zu bestimmen.

Einblick in die verschiedenen Phasen der Oligodendrozyten-Differenzierung wurde durch die Identifizierung von Stufe spezifische Zellmarker ermöglicht worden. Selbst erneuernden frühen Vorläuferzellen durch ihre Expression von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor alpha (PDGFRα), neuronalen / Glia-Antigen 2 (NG2) und A2B5 ⁶ definiert sind ^{– 8.} Als OPC ihre Differenzierungsprogramm und ziehen sich aus dem Zellzyklus einleiten, herunterregulieren sie Expression dieser Marker und beginnen Proteine ​​zu exprimieren bezeichnend für Oligodendrozyten mit zyklisch-Nukleotid-3'-Phosphodiesterase (CNPase) und O4 premyelinating. Schließlich deren Differenzierung in reiferen oligodendrocytes wird durch die Expression von Myelin-assoziierten Proteine, einschließlich Myelin-assoziiertes Glykoprotein (MAG), Proteolipidprotein (PLP) und basisches Myelinprotein (MBP) aus. MBP ist ein intrazelluläres peripheren Membranprotein und ein Hauptbestandteil der Myelinscheide. Mäuse entwickeln fehlt MBP einen schweren Phänotyp, in dem CNS Myelinisierung deutlich zu Zittern verringert führt, ist, Krämpfe und frühen Tod ^9,10. Diese wichtige Rolle der MBP in Myelinisierung hat zu seiner Verwendung als ein Marker für Oligodendrozyten Differenzierung führte sowohl in vitro als auch in vivo ^11.

Quantifizierung von MBP kann mit verschiedenen Methoden erreicht werden. RT-PCR und Western Blot-Analyse ermöglichen eine Quantifizierung der MBP-Niveaus unter verschiedenen Behandlungsschemata. Immunzytochemie ist eine gemeinsame qualitative Ansatz, der auch quantitativ sein können, wenn die Kamera-basierte Mikroskopie Ansätze verwendet werden. Obwohl diese Systeme sind zuverlässig und grundlegenddas Studium der Oligodendrozyten-Differenzierung, sie haben jeweils ihre eigenen Nachteile, die ihre Verwendung in Arzneimittel-Screening begrenzen. Erstens, die Menge der primären OPCs, die für RT-PCR und Western Blot-Analyse erforderlich sind, reduziert die Anzahl der Variablen, die gleichzeitig untersucht werden können. Während die Zelle Voraussetzung für Immunzytochemie viel niedriger ist, müssen erhebliche Zeit zu jedem Experiment gewidmet werden, wenn die Quantifizierung ist das Ziel. Zahlreiche Bilder müssen experimentelle Analyse zu erleichtern eingefangen und dann quantifiziert werden. Diese Einschränkungen werden wichtige Hindernisse für Studien zu berücksichtigen, die einen hohen Durchsatz Beurteilung erfordern. Hier beschreiben wir eine Methode, die grundlegenden Aspekte von nutzt sowohl der Immunzytochemie und Western Blot Methoden zur Quantifizierung Myelin, während erheblich sowohl die Anzahl von Zellen erforderlich ist und die Zeit zu reduzieren quantitative Analyse durchzuführen.