のトランスクリプトームプロファイリング<em>生体内で</em二色マイクロアレイプラットフォームを使用>産ウシ着床前の胚
Summary
Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.
Abstract
Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.
Introduction
高生産乳牛における初期胚損失は、酪農業1、2における主な課題の一つです。牛は、それらの同様の発達過程3、4に対するヒト着床前胚発生を研究するための興味深いモデルとなっています。しかしながら、多くの研究は、ウシ初期胚発生に関与する遺伝子についてのより良い理解が必要です。
1995年5に開発された最初のマイクロアレイ技術から二十年後に、より洗練されたプローブの製造技術の開発は、異なるマイクロアレイプラットフォーム6内との間に印刷エラーとアレイチップのばらつきが減少しました。改善されたマイクロアレイ技術は、初期胚Qに、臨床研究7で、より最近では、この技術の普及応用をもたらしましたualityアセスメント8。
マイクロアレイ技術のために必要な大量の材料は、マイクロアレイ技術は、最初に、このような初期胚発生などの研究分野の番号を入力することができなかった主な理由です。より最近では、RNA増幅法は、直線的にサブナノグラム出発RNA材料9からマイクログラムレベルまでRNAを増幅するために改良されてきました。市場で入手可能ないくつかの市販のRNA増幅キットがあります。しかし、より人気のよく発達したキットが11の方法を駆動リボ単一プライマー等温増幅10およびT7プロモーターに関連しています。最も人気のあるアンチセンスRNA増幅は、5 '末端12にT7プロモーターに連結するオリゴdTプライマーを用いてインビトロ転写を使用します。この技術は、線形増幅F後代表アンチセンス転写物の大部分を維持することができまたはアレイハイブリダイゼーション13。この方法は、ウシの胚8から抽出した全RNAのピコグラムレベルを増幅するように適合されています。
ユニバーサルリンケージシステム（ULS）は、DNAを直接組み込むか、グアニン14のN7位の配位結合を形成することにより、白金リンク蛍光色素シアニン547またはシアニン647のいずれかでRNAを増幅した標識法です。この方法は、アミノアリルに比べて変更することなく、より安定した増幅されたaRNAを生成するために、胚の研究に適合させた酵素法15によって生成されたaRNAを変更しました。単一の色素と2つの色素の両方の標識方法は、マイクロアレイにユニバーサルリンケージシステムを使用して適応されています。大規模なマイクロアレイの比較研究は、6 1次元と2色配列のプラットフォーム間でのデータ品質の良好な相関があるということでした。
最近では、両方のT7プロモータードライブnは、アンチセンスRNA増幅およびULS標識方法は、マイクロアレイハイブリダイゼーション8、16のためのaRNA材料標識高品質の十分な量を生成するために、より信頼性の高いプロトコルを提供するために開発されてきました。そこで、本研究では、一例として、7日目ウシ胚を用いた2色マイクロアレイに関わるデータ解析にRNA抽出からの重要なステップのいくつかを実証するためのプロトコルを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
7日目のウシの胚を用いてマイクロアレイ解析を行うための第一の問題は、遺伝子発現を研究するため、高品質のRNAの十分な量を取得していません。伝統的なフェノール/クロロホルムRNA抽出およびエタノール沈殿法は、低収量およびRNA増幅反応を阻害する可能性の残りのフェノールが得られ、7日目の胚にはお勧めできません。代わりに、標準的な列ベースの方法は、全RNAを単離し、その後、…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates – BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
Materials
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2X Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25X Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10X GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | – |
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